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小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化中CBF1的作用
目的揭示CBF1在骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化过程中的作用.方法采用基因转染法建立CBF1稳定过表达细胞系Kusa-A1/CBF1,检测其成骨活性.指标包括细胞钙沉积能力、碱性磷酸酶活性、体外钙化结节(CN)形成、实时PCR测定细胞骨钙素(OC)和骨桥蛋白(OPN)基因表达、蛋白印迹检测细胞RANKL蛋白.后用报告基因法检测CBF1对HES1启动子活性的影响.结果经RT-PCR和Western blot鉴定,Kusa-A1/CBF1细胞建立成功.与对照细胞系Kusa-A1/host相比,Kusa-A1/CBF1细胞的钙沉积能力、CN形成能力均显著提高;Kusa-A1/CBF1细胞OC和OPN基因表达和RANKL蛋白水平明显高于对照细胞.瞬时转染Notch的细胞内结构域NICD促进HES1的启动子活性,这一作用被CBF1强烈抑制.结论CBF1可以促进Kusa-A1的成骨分化,该作用至少部分是通过影响Notch信号实现的.
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Notch和HES蛋白表达在大鼠静脉桥狭窄中的作用
目的 研究Notch和HES蛋白表达在大鼠静脉桥狭窄中的作用.方法 将大鼠颈外静脉移植至颈总动脉建立静脉桥移植模型,术后随机分为对照组、DAPT组和DMSO组,在术后28 d收集移植静脉,行HE染色后分别观察静脉壁中层厚度和PCNA阳性指数,用Western blot测定Notch1和HES1蛋白的表达.结果 Notch和HES蛋白在静脉桥狭窄中的表达显著高于对照组(P＜0.05).同时与安慰剂DMSO相比,DAPT不但能够显著抑制Notch和HES蛋白表达,也可显著抑制vSMCs增生(P＜0.05).结论 抑制Notch信号蛋白可以缓解静脉桥狭窄.
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Notch信号通路对胶质瘤干细胞的调控作用研究进展
胶质瘤干细胞(GSCs)是胶质瘤放化疗耐受和复发的重要原因.而Notch信号通路对GSCs形成、维持及胶质瘤患者放化疗耐受中起关键的调控作用.因此,深入研究GSCs中Notch信号通路调控机制对开发以该通路为靶向的治疗药物具有积极意义.
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阻断Notch信号对疫苗增强性免疫病理的作用
目的 探讨阻断Notch信号对FI-RSV疫苗增强性免疫病理的调节作用. 方法 制备加入佐剂Al(OH)3的FI-RSV疫苗,肌注免疫C57BL/6小鼠2次,检测抗体;攻毒后,检测各组体重变化,并作肺组织切片及染色检查和细胞因子转录表达检测. 结果 免疫前各组血清IgG抗体水平无显著差异;免疫后,FI-RSV+ Al(OH)3组体重下降显著;病理切片PAS染色显示FI-RSV+ Al(OH)3和FI-RSV+ Al(OH)3+L-685,458组的粘液分泌均较明显,病理切片HE染色显示FI-RSV+ Al(OH)3和FI-RSV+Al(OH)3+L-685,458组肺部均显示大量炎症细胞浸润,炎症反应较强,FI-RSV+Al(OH)3组炎症反应倾向于肺泡壁,FI-RSV+ Al(OH)3+ L-685,458组炎症反应倾向于气管壁和血管周;FI-RSV+Al(OH)3组肺组织RSV-N基因的表达量与FI-RSV+ Al(OH)3+L-685,458组比较差异无统计学意义(P＞0.05),FI-RSV+Al(OH)3组的IFN-γ、TNF-α、T-bet、IL-17、ROR-γt基因的表达量显著高于其他两组(P＜0.05),FI-RSV+ Al(OH)3 +L-685,458组IL-4、IL-5、GATA-3基因的表达量显著高于其他两组(P＜0.05). 结论 Al(OH)3单独作为佐剂比添加L-685,458诱发Th1及Th17型优势应答和以肺泡壁反应为主的炎症反应强;Notch信号阻断后诱发的Th2型优势应答及以气管壁和血管周反应的炎症反应更强.
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Notch信号在造血祖细胞扩增中作用的研究进展
造血祖细胞扩增具有十分重要的临床价值,传统的方法扩增往往导致造血祖细胞的分化.Notch受体和配体在造血系统中广泛存在,活化的Notch信号可抑制造血祖细胞的分化而促进其扩增,提示可以通过Notch信号途径实现对造血祖细胞的扩增.本文就Notch信号通路、Notch信号与造血祖细胞维持、Notch信号与造血祖细胞扩增,Notch信号维持造血祖细胞未分化状况的分子机制,进行了综述.
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阿霉素诱导的骨髓瘤细胞化疗耐药的分子机制分析
本研究旨在探讨阿霉素诱导的骨髓瘤细胞RPMI8226化疗耐药的分子机制,分析Notch信号过度活化在化疗耐药机制中的作用.以浓度梯度递增法建立耐阿霉素的骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX,针对化疗耐药的瘤细胞RPMI8226/DOX,用RT-PCR法检测细胞耐药前后Notch2、Jagged1、Jagged2、HES1基因表达变化;Western blot检测耐药细胞系与敏感细胞系P-170蛋白表达变化;ELISA方法分析IL-6、VEGF水平变化.结果显示,Notch2、Jagged1、Jagged2基因随着耐药程度的增高表达逐渐增高,而HES1则相反,随着耐药程度增高表达逐渐减低.P-170蛋白随着耐药程度的增高表达逐渐增高.耐药细胞组培养上清中细胞因子VEGF和IL-6水平显著高于普通培养组.结论:建立的人骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX可以作为骨髓瘤耐药研究的有效模型,Notch信号通路的活化与多发性骨髓瘤的耐药密切相关,Notch信号通路有望成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点.
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异硫氰酸苯已酯抑制骨髓瘤细胞Notch信号表达的研究
为了研究异硫氰酸苯已酯(phenylhexyl isothiocyanate,PHI)在体外对骨髓瘤细胞RPM18226增殖抑制的分子机制,用不同浓度PHI与RPMI8226细胞共同孵育,用MTT比色法检测PHI处理后细胞增殖抑制;用DAPI染色现察PHI处理后细胞凋亡;Westem blot检测PHI处理后瘤细胞Notch1、Jagged2、BCL-2和P-Akt蛋白表达变化.结果显示,PHI在一定浓度范围内能抑制瘤细胞增殖,诱导瘤细胞凋亡,其抑制效应具有时间和浓度依赖性.PHI可以下调瘤细胞中Notchl和Jagged2蛋白的表达并呈时间和浓度依赖性,同时降低BCL-2和p-Akt的表达.结论:PHI在体外能够抑制骨髓瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡;细胞凋亡的发生与PHI抑制Notch信号及其下游靶基因p-Akt和BCL-2的表达有关,PHI可能成为新一代的Notch信号抑制剂,是一种潜在的骨髓瘤治疗药物.
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激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节.Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一,它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚.本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用.利用RT-PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch-1胞内区(Intracellular domain of Notch,ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株,以建立激活Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系;采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡.结果表明:RT-PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达Notch-1及相关分子,逆转录病毒可以介导外源Notch-ICN在骨髓瘤细胞中表达,激活Notch信号可以抑制二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine,DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡.结论:Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用,这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点.
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Notch信号在血管疾病炎症反应中的作用
Notch信号通过控制关键细胞功能维持血管稳态.本文介绍了在血管疾病炎症反应中,炎症如何影响血管细胞中的Notch信号和Notch信号对炎症过程的功能作用以及Notch信号和其他信号传导途径之间级联关系.本文将系统阐述Notch信号在血管疾病炎症反应中的作用.
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靶向重组信号结合蛋白-Jκ干扰腺病毒对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化影响的体内研究
目的 通过体内实验探讨重组信号结合蛋白-Jκ(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region,RBPJκ)在四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化发生发展中的作用.方法 选取雄性SD大鼠40只为研究对象,以40％CCl4腹腔注射法制备SD大鼠肝纤维化模型.将大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、腺病毒空载体组(治疗对照组)和RBPJκ干扰腺病毒(AdshRBPJκ)干预组(治疗组),每组各10只.采用苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色和天狼猩红染色观察细胞外基质(extracellular matrix,ECM)含量;采用碱水解法测定大鼠肝组织羟脯氨酸含量;采用qPCR、Western blot和免疫组织化学法检测大鼠肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1、RBPJκ及其靶基因Hey2、HeyL和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指标[蜗牛家族转录抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail 1)、波形蛋白和E-钙连接素]的表达.结果 ①与正常对照组相比,HE染色、Masson染色和天狼猩红染色示模型组大鼠肝细胞明显肿胀、变性,肝小叶结构被破坏,纤维组织增生明显;模型组大鼠肝内羟脯氨酸含量显著高于正常对照组[(99.35±8.12)μg/mgvs(285.12±12.32)μg/mg,t=38.193,P<0.001)].②RT-PCR、Western blot及免疫组织化学结果显示,模型组大鼠RBPJκ靶基因Hey2、HeyL、胶原相关基因(α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1)以及EMT相关基因Snail 1和波形蛋白转录及翻译水平的表达均显著增加(P均<0.05),但E-钙连接素表达水平降低(P<0.05).③与治疗对照组相比,AdshRBPJκ(治疗组)可改善大鼠肝纤维化程度,降低羟脯氨酸含量[(193.52±13.12)μg/mgvs(279.85±8.32)μg/mg,t=15.92,P<0.001)].④RT-PCR、Western blot及免疫组织化学结果显示,与治疗对照组相比,抑制肝RBPJκ表达(治疗组)不仅可降低RBPJκ及其靶基因Hey2、HeyL的表达水平,也可降低纤维化指标(α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1)及EMT相关基因(Snail 1、波形蛋白)的表达水平,同时还可上调E-钙连接素的表达(P<0.05).结论 高表达的RBPJκ可能参与了肝纤维化的形成过程,抑制RBPJκ可能为肝纤维化的防治提供新方向.
关键词： 肝纤维化 重组信号结合蛋白-Jκ Notch信号 上皮间质转分化 -
Notch信号和核因子-κB信号通路与心肌梗死后心室重构之间关系的研究进展
心室重构是急性心肌梗死进展为心力衰竭的重要原因，如何预防和（或）逆转心肌梗死后心室重构是心力衰竭防治的热点问题，但目前心室重构发病机制仍未彻底阐明。Notch信号和核因子-κB信号与心肌梗死后心室重构关系密切。本文就这两个信号通路与心室重构之间关系的研究进展做一综述。
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Notch信号与心脏发育
Notch信号是一条保守的信号传导途径,它广泛表达于从无脊椎动物到哺乳动物等各种生物体内.Notch信号决定着一些胚胎发育过程中的关键进程,例如:决定细胞分化命运,影响胚胎的形成,以及促进细胞的增殖与分化[1].
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人骨髓间充质干细胞中 Notch 信号上调对破骨细胞增殖的调控
目的：通过研究Notch信号上调的人骨髓间充质干细胞（ human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells ， hBMSCs ）对破骨细胞增殖调控的机制，探讨Notch信号在成骨-破骨偶联中的作用。方法用装载Notch信号胞内域NICD1的慢病毒载体（Lentivirus， Lv）转染hBMSCs，收集其分泌的条件培养液（Conditioned Medium，CM）。培养前破骨细胞系RAW264.7，模拟共培养环境。定量RT-PCR和ELISA测定转染前后hBMSCs表达和分泌的M-CSF的情况。 cck-8和单板克隆试验测定RAW264.7的增殖情况。结果转染慢病毒后，hBMSCs表达和分泌的M-CSF均有所上调（分别为P＜0.01和 P＜0.05）；CCK-8和单板克隆试验的结果显示hBMSCs分泌的CM使RAW264.7的细胞数量增加（均为P＜0.01）。结论 Notch信号上调的hBMSCs可以通过影响M-CSF的表达和分泌，作用于破骨前体细胞，促进其增殖。
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Notch1信号系统对胰腺癌干细胞增殖与分化的调控
目的 探讨激活的Notch1信号系统对PANC-1胰腺癌干细胞增殖与分化的调控.方法 向体外培养的胰腺癌干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂MW167,空白对照加PBS缓冲液.RT-PCR、Western印迹和流式细胞术等方法 检测Notch1信号系统的表达,及加入激活剂rhNF-κB和抑制剂MW167后,CD44和CD24的表达,以及细胞周期的变化.结果 胰腺癌干细胞中Notch信号系统的4个受体只有Notch1表达,配体只有JAG1表达;对照组的S期和G2期为21.5%和12.7%,使用MW167诱导时,细胞周期的S期和G2期所占的百分比降为17.2%和10.5%,干细胞所表达的CD44和CD24亦显著降低(P<0.05或P<0.01);而使用rhNF-κB诱导,则S期和G2期所占的百分比显著增高为29.3%和15.2%,同时CD44和CD24表达也增高(P<0.05或P<0.01).结论 当Notch信号系统被激活时,胰腺癌干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,胰腺癌干细胞进行分化.
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肺动脉高压大鼠肺组织Notch信号的改变
目的 探讨肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)大鼠肺组织Notch受体的改变.方法 构建肺切除+野百合碱PH大鼠模型,与正常大鼠比较肺血管重构指标的改变.进行肺组织免疫组化Notch 1～Notch 4受体染色和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测 (Notch 1～Notch 4) mRNA.结果 肺切除+野百合碱组大鼠平均肺动脉压力(mPAP)、右心指数[fulton index, RV/(LV+S)]、肺小动脉中膜厚度百分比(WT,%)、非肌性小动脉肌化程度、管壁细胞增殖度,明显高于正常大鼠,差异有显著意义(P<0.05),有新生内膜形成.肺组织免疫组织化染色,肺切除+野百合碱组和正常对照组大鼠肺动脉均有Notch 1,Notch 3,Notch 4受体表达,未见Notch 2受体表达.Notch 1表达于血管内皮细胞和平滑肌细胞,Notch 3主要表达于平滑肌细胞,Notch 4主要表达于内皮细胞.肺切除+野百合碱组肺组织(Notch 1～Notch 4) mRNA水平高于正常对照组.结论 Notch 1,Notch 3,Notch 4表达于肺动脉,随着PH肺血管重构的发生,表达上调.Notch信号很可能参与了PH肺血管重构过程.
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Notch信号:抗眼内新生血管的新靶点
眼内新生血管形成是多种眼部血管性疾病后期的共同结局,是导致视力损害的主要原因.参与眼内新生血管形成的细胞及分子机制十分复杂.大量研究显示,Notch信号通路是调节血管发育和维持血管功能的重要通路,可通过影响一系列分子表达及细胞行为,调控眼内新生血管的发生发展.随着Notch信号靶向药物进入临床试验,Notch信号可能成为眼内新生血管性疾病治疗的新靶点.
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Notch信号在放射损伤小鼠骨髓基质细胞中的表达
目的 探讨小鼠骨髓基质细胞放射损伤后Notch信号的表达.方法 应用小鼠骨髓基质细胞体外放射损伤模型,采用RT-PCR检测了小鼠骨髓基质细胞Notch1、Jagged1、Hes1基因的表达.结果 正常小鼠骨髓基质细胞中未见Notch1受体、Notch1配体Jagged1、Notch通路活化的下游基因Hes1mRNA的表达,给予60Co γ射线照射后2 h即可见上述基因的表达,照射后4 h达高峰,8～12 h恢复正常.各组间比较,差异有统计学意义(P＜0.001).结论 γ射线作用于小鼠骨髓基质细胞后有Notch通路的活化.Notch通路参与了小鼠骨髓基质细胞的放射损伤过程.
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γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号逆转马兜铃酸诱导的肾小管细胞表型转化
目的：探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT对马兜铃酸（AA）诱导引起肾小管上皮细胞表型转化与胶原累积的作用及分子机制。方法将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为正常细胞对照组、AA 10 mg·L-1组、AA 10 mg·L-1+DAPT1和10μmol·L-1组。24 h后，实时荧光定量PCR检测Notch信号关键分子Notch1、Jagged1和Numb、表型转化相关分子转化生长因子β1（TGF-β1）、E-钙黏着蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、骨形态发生蛋白7（Bmp7）和基质成分Ⅰ型胶原a1（Col1a1）和Ⅲ型胶原a1（Col3a1） mRNA的表达；细胞免疫荧光染色法检测Notch1、Jagged1、α-SMA和Col3a1蛋白的表达。结果与正常细胞对照相比，AA处理后，肾小管上皮细胞基质相关因子TGF-β1，α-SMA和Col3a1 mRNA表达上调，上皮标志物E-钙黏着蛋白mRNA的表达受到抑制，而且导致了Notch1、Jagged1 mRNA表达的上调和Numb mRNA表达的下调（P<0.05），提示AA促进肾小管上皮细胞表型转化与基质累积，同时激活了Notch信号通路。DAPT干预AA作用后，Notch1（P<0.01）和Jagged1（P<0.05）的mRNA表达下调，Numb mRNA表达上调（P<0.05），说明DAPT抑制了AA诱导的Notch信号通路活化。此外，与AA损伤组相比，DAPT也降低了TGF-β1，α-SMA，Col1a1和Col3a1 mRNA表达（P<0.05），提高BMP-7和E-钙黏着蛋白mRNA表达（P<0.05），提示DAPT抑制了AA诱导的上皮细胞的表型转化与基质累积。结论 DAPT抑制AA诱导的肾小管上皮细胞的表型转化与基质累积，其可能机制是DAPT靶向干预Notch信号的活化。
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人源性Notch1跨膜段真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建人源性Notch1跨膜段(notch1 transmembrane domain,NTM)真核表达载体pcDNA3-NTM,并观察其在真核细胞中的表达.方法 通过反转录-聚合酶链反应从人胰腺癌细胞系BxPC3细胞中获得编码Notch1跨膜段的cDNA,定向克隆至C端带flag蛋白标签序列的真核表达载体pcDNA3中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内Notch1跨膜区的表达.结果 构建了真核表达载体pcDNA3-NTM,将其转染HeLa细胞48 h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Notch1跨膜段的表达显著增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3-NTM,为研究Notch信号的活化机制及其在胰腺癌发生发展中的作用奠定了基础.
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HEY基因家族在哺乳动物心血管发育中的作用
哺乳动物的HEY基因家族与果蝇Hairy基因具有相似的螺旋-环-螺旋结构,二者均为转录因子,是目前发现的Notch信号通路中为数不多的靶基因之一.本文旨在通过对HEY基因家族结构与功能的特点分析,阐释它们在心血管发育中的重要作用,从而为揭开HEY基因家族对心血管发育的作用机制及分子调控机制提供理论基础.
