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基因编辑技术的研究进展及其在中药研究中的前景展望
基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术,可对特定DNA片段进行敲除、加入和替换等,从而在基因组水平上进行精确的基因编辑.其技术本质均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复,联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变.基因编辑技术在科研、农业、医疗等领域都具有极其广泛的发展前景和应用价值.在疾病基因治疗领域,基因编辑技术在癌症如白血病、遗传性疾病如血友病、地中海贫血、多种肌肉营养障碍症和逆转录病毒相关传染病如艾滋病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩:结合基因编辑技术开展的实验新方法学研究及动物模型的制备工作也在迅猛地发展和完善;世界各地的实验室也已将基因编辑技术应用于预防疟疾、器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活等多个研究领域.该文就基因编辑技术在上述领域中的研究进展进行一些概括和总结.此外还归纳了一些当前针对基因编辑技术存在的争议和思考,并初步探讨了该技术在中药研究中的潜在应用前景.
关键词： 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 ZFNs TALENs -
基因工程大鼠研究进展
相对小鼠而言,大鼠在生理、行为、代谢等方面更接近人类.近年随着基因工程大鼠技术的开发,大鼠开始回归于生命科学实验和医药研究,基因工程大鼠的研究成为实验动物科学的热点.目前适用于大鼠基因工程的技术各有优缺点.本文对大鼠转基因技术,转座子技术,ZFN锌指酶技术,TALENs技术和基于胚胎干细胞的基因打靶技术的研究进展做了比较.
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Nanog 调控细胞周期相关蛋白影响 HepG2细胞增殖能力
目的：研究多能性因子Nanog 对HepG2细胞周期相关蛋白表达的影响，进而探索其对HepG2细胞增殖能力的影响。方法本研究通过基因编辑工具TALENs介导Nanog突变而下调其表达， T7E1内切核酸酶和基因测序分析Nanog突变率，Western blot 检测Nanog蛋白表达水平，RT－PCR检测Nanog mRNA表达水平，实时细胞活性检测系统检测野生型HepG2细胞和Nanog突变的单克隆HepG2细胞的增殖能力。结果 TALENs成功介导Nanog基因突变，两次转染Nanog－TALENs质粒后，T7E1酶切分析混合细胞的打靶效率近40％。突变的单克隆HepG2细胞Nanog mRNA表达水平较野生型HepG2细胞表达下调3．4倍，而Nanog蛋白表达水平表达下调3．6倍。 Nanog突变的单克隆HepG2细胞细胞周期相关蛋白CyclinD1／D3、CyclinE1和CDK2较野生型HepG2细胞表达均下调，Nanog突变的单克隆HepG2细胞表现出明显减弱的增殖能力。结论本研究证实了Nanog 通过调控细胞周期相关蛋白CyclinD1／D3、CyclinE1和CDK2影响HepG2细胞增殖，下调Nanog表达可能通过调控细胞周期相关蛋白的表达而抑制HepG2细胞增殖能力。
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TALENs介导的Nanog基因表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响
目的 研究Nanog表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响.方法 通过基因编辑工具转录激活样效应器核酸酶(TALENs)介导Nanog下调表达,基因测序分析Nanog的突变情况;挑取单个细胞培养以筛选出Nanog明显下调表达的单克隆HeLa细胞;RT-PCR检测mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;HeLa细胞的集落形成能力、侵袭性及耐药性分别通过集落形成实验、Transwell侵袭实验及药物敏感性实验检测.结果 TALENs成功介导Nanog基因突变并导致其下调表达,Nanog突变的单克隆HeLa细胞NanogmRNA和蛋白表达水平较野生型HeLa细胞均下调表达(P＜0.05).Nanog突变单克隆HeLa细胞相对于野生型HeLa细胞表现出明显减弱的侵袭、集落形成及化疗药物抵抗能力(P＜0.05).结论 Nanog突变减弱HeLa细胞的恶性行为,下调或沉默Nanog表达有望成为一种新型的治疗宫颈癌策略.
