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MERS-CoV棘突蛋白主要特性及B/T细胞抗原表位预测分析
目的 应用生物信息学方法分析中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)棘突蛋白(Spike,S)的主要特性,预测可能的B/T细胞抗原表位. 结果 MERS-CoV的S蛋白氨基酸序列基本保守,具有多个糖基化、酰胺化及磷酸化翻译后修饰位点.综合各种单参数预测MERS-CoV S蛋白可能存在4个B细胞抗原表位、7个CTL细胞表位和5个Th细胞表位. 方法 以MERS-CoV S蛋白的氨基酸序列一级结构为基础分析其保守性,采用ProtParam预测S蛋白的理化特性,SOPMA预测其二级结构,Motif Scan预测翻译后修饰位点,DNAStar分析其序列的亲水性指数、柔韧性指数、可及性参数以及抗原指数,推测B细胞抗原表位的可能位置,采用SYFPEITHI的T细胞表位预测工具预测CTL和Th细胞表位. 结论 生物信息学方法预测MERS-CoV S蛋白氨基酸保守序列,该蛋白可能含有B/T细胞抗原表位,为MERS-CoV疫苗研制及其他相关研究奠定了基础.
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SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建及其免疫学分析
目的 构建基于SARS病毒Spike(S)蛋白的重组腺病毒,并对该重组腺病毒进行初步鉴定和免疫学探讨.方法 通过全基因合成得到全长S蛋白基因,利用Ad5腺病毒系统构建S蛋白基因的重组腺病毒,采用间接免疫荧光(IFA)试验和蛋白免疫印迹法(Western blot)对S蛋白的表达进行鉴定,再用重组腺病毒免疫小鼠,观察小鼠抗体诱生情况,从而对该重组腺病毒的免疫效果进行初步评价.结果 PCR 扩增重组腺病毒质粒外源片段,大小为800 bp,与预期值一致;Western blot和IFA结果表明,重组腺病毒(rAd-S)表达S蛋白能被马抗SARS血清识别;ELISA检测结果显示,rAd-S能刺激小鼠机体产生抗体.结论 重组腺病毒系统成功表达了SARS病毒S蛋白,免疫小鼠产生S蛋白特异的抗体.
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人冠状病毒HKU1 Spike蛋白受体结合域结构预测
[目的]探索人冠状病毒HKU1(human HKU1 coronavirus,hHKU1-CoV)Spike蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白结构.[方法]利用已经发表的hHKU1-CoV Spike基因序列,通过蛋白建模获得该冠状病毒Spike空间结构,运用PDBsum平台进行蛋白结构分析.[结果]人冠状病毒HKU1-CoV Spike氨基酸序列(No.AGW27881.1) 535 ～673位可能存在RBD,二级结构显示该区域共有4个β折叠股、6个α螺旋,2个β-α-β单元.蛋白质空间结构分析显示RBD可分为核心区和Loop区.核心区由2个平行的β折叠股和4个α螺旋顺序链接组成,Loop区位于核心区外围,由ASN589-PRO673之间氨基酸构成1个含有3个边缘的柔性区域和2个反向平行的β折叠共同组成的腔隙结构,该区域可能是hHKU1-CoV与宿主受体作用的关键部位.[结论]hHKU1-CoV Spike蛋白与宿主受体作用的关键部位可能位于SER606～PRO673,这与已知结构的β冠状病毒相同区域在Loop区存在差异,但冠状病毒受体尚需进一步探索.
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SARS相关冠状病毒Spike蛋白定点诱变
目的 分析确定SARS-CoV Spike蛋白序列中对SARS-CoV的感染能力相关性较强的位点,并进行定点诱变.方法 比对不同来源株SARS-CoV的Spike蛋白的序列,计算其相应位点的突变墒值和突变几率,结合进一步的生物信息学分析,筛选出经预测可能影响Spike蛋白与其受体结合进而导致SARS病毒对宿主细胞的膜融合侵染能力的7个位点,对各个位点用重叠延伸PCR法或直接PCR法进行人工定点诱变,获7个突变片段,之后将各片段亚克隆至克隆载体PSP72中.结果 经PCR和测序确认各片段点突变成功,并正确插入克隆载体PSP72中.结论 成功实施Spike蛋白的定点诱变,获得7个突变片段的重组子,这些突变体可为研究这些突变位点在Spike蛋白与受体结合中的意义,进而可为阐述Spike蛋白的结构与功能的关系、揭示Spike蛋白变异与SARS病毒侵入(染)细胞能力的相关性提供坚实的实验基础.
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严重急性呼吸综合征冠状病毒Spike蛋白诱发小鼠免疫损伤的实验研究
目的 研究严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的Spike蛋白(S蛋白)引起免疫病理损伤的分子机制.方法 采用信号转导通路发现者基因芯片筛选相关诱导免疫炎症的信号转导通路基因的表达,通过RT-PCR对基因芯片筛选基因进一步验证并观察信号分子阻断剂干预的影响;将SARS-CoV的S蛋白及信号分子阻断剂分别经气管滴注、尾静脉注射的途径感染BALB/c小鼠,通过免疫组织化学观察肺及免疫器官的病理变化.结果 S蛋白诱导了与γ干扰素(IFN-γ)类似的JAK-STAT的信号通路相关基因的表达,RT-PCR证实S蛋白诱导了人支气管上皮细胞的γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因表达,该作用能够被JAK3抑制剂完全阻断.经气管滴注或尾静脉注射S蛋白均可引起小鼠肺损伤和脾脏损伤.JAK3抑制剂能够抑制S蛋白诱导小鼠肺内IP-10表达,减轻病理损伤.结论 JAK-STAT信号转导通路的激活可能在SARS-CoV的S蛋白诱导的以IP-10为代表的炎症级联中起重要作用,该发现可为发展抗SARS病毒诱导的免疫损伤治疗提供新的策略.
关键词： 严重急性呼吸综合征 冠状病毒 Spike蛋白 γ干扰素诱导蛋白10 -
SARS病毒Spike蛋白具有中和活性的抗原表位预测和初步鉴定
目的:预测并合成SARS病毒Spike蛋白中具有中和活性的抗原表位,鉴定其在免疫检测和疫苗设计中的作用.方法:使用二级结构以及基因组对比预测方法,预测Spike蛋白中具有较高抗原活性的肽段序列并人工合成.用直接ELISA法检测在SARS确诊阳性患者血清和健康人血清之间相应抗体的检出差别,确定预测肽段是否为SARS的抗原肽段.结果:预测并人工合成了具有抗原活性的GEVFNATKFPSVYAW多肽,在ELISA检测中,可检测出SARS阳性血清中的针对性抗体,阳性符合率为71.4%,在健康人血清中不能检测出对应的抗体,阴性符合率为92%.结论:预测并合成了具有SARS病毒Spike蛋白的中和表位抗原,其特异性高于全病毒抗原,为SARS的诊断及疫苗的设计奠定了基础.
