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nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒XJ-160复制子载体特性的影响
为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A.将新霉素抗性基因(Neomycin~r,Neo~r)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorcscent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响.实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快.替换突变nsP2726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力.而pBRep-726S则具有中间表型.提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程.这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础.
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XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型
XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,在对其全基因组核苷酸序列测定的基础上,对病毒基因组序列、病毒同源性和病毒系统进化等进行了较为详细的分析,结果表明:XJ-160病毒具有典型的甲病毒属辛德毕斯病毒的序列特征.该病毒nsp3蛋白基因中有11处缺失及两处插入(4517～5485),涉及90个核苷酸.核苷酸序列的系统进化分析表明,XJ-160病毒属于辛德毕斯病毒欧洲/非洲亚组.病毒全基因组核苷酸序列进化分析显示,XJ-160病毒是一株新的甲病毒或辛德毕斯病毒的新亚型.
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辛德毕斯病毒复制子载体系统的构建
XJ-160病毒是我国分离的一株辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV),隶属于披膜病毒科(Togaviridea)甲病毒属(Alphavirus)[1,2].
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RNAi抑制XJ-160病毒复制的研究
目的通过建立RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制XJ-160病毒复制的模型,在序列特异性、位置效应和量效关系等方面,探讨RNAi对XJ-160病毒复制的影响,为进一步研究RNAi的抗病毒作用和机制奠定基础. 方法按照siRNA(short interferencing RNA)的设计要求合成XJ-160病毒特异siRNA,脂质体法转染BHK-21细胞后感染XJ-160病毒,通过测定病毒滴度、蛋白表达量及XJ-160病毒RNA合成研究siRNA对XJ-160病毒复制的抑制. 结果成功建立了RNAi抑制XJ-160病毒复制的模型,探讨了RNAi抑制该病毒复制作用的特点. 结论外源导入的siRNA能够抑制XJ-160病毒的复制,并且这种抑制作用具有明显的序列特异性、位置效应和存在量效关系等特点;siRNA是通过降解病毒RNA实现抑制病毒复制作用的.
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XJ-160病毒复制子型表达载体的构建
XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.
