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辛德毕斯病毒及其与疾病关系研究进展
辛德毕斯病毒(sindbis virus,SINV)是所有已知虫媒病毒中分布为广泛的病毒.该病毒不仅能引起人类发热、皮疹和关节炎症状,更重要的是它所引起的疾病容易发展为慢性,对人类健康造成严重危害.在中国已经从发热患者血清、三带喙库蚊和中华按蚊中分离到多株辛德毕斯病毒,而且血清流行病学调查结果表明人群中普遍存在辛德毕斯病毒感染.因此,我们对辛德毕斯病毒及其与疾病关系进行了综述.
关键词： 辛德毕斯病毒 辛德毕斯病毒与疾病关系 -
亚甲蓝光敏法对人血浆中病毒的灭活研究
向人血浆中加入1μmol/L亚甲蓝,以10000 lx强度的溴钨灯光照射5 min,可灭活106.5TCID50的水泡性口炎病毒与107.TCID50的辛德毕斯病毒;作用2 min可灭活10509 TCID50的人免疫缺陷1型病毒.但作用60 min仍不能破坏HBsAg抗原性.
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中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析
报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定.利用RT-PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6 RNA聚合酶启动子之后,基因组3'末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆.该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增.经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到107～108pFU/ml.全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8 453位核苷酸由C变为T)产生Xba Ⅰ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在.从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆.该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具.
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三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆
利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒 XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR.通过此融合片段两端引入的Xba I和Xho I酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cDNA克隆,命名为pBR-XJ160YE1.该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变.间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达.提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆.此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具.
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XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型
XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,在对其全基因组核苷酸序列测定的基础上,对病毒基因组序列、病毒同源性和病毒系统进化等进行了较为详细的分析,结果表明:XJ-160病毒具有典型的甲病毒属辛德毕斯病毒的序列特征.该病毒nsp3蛋白基因中有11处缺失及两处插入(4517～5485),涉及90个核苷酸.核苷酸序列的系统进化分析表明,XJ-160病毒属于辛德毕斯病毒欧洲/非洲亚组.病毒全基因组核苷酸序列进化分析显示,XJ-160病毒是一株新的甲病毒或辛德毕斯病毒的新亚型.
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我国首次分离的辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)全基因组核苷酸序列测定
对我国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株全基因组核苷酸序列进行测定,阐明该病毒基因组与国外株的差异,了解其分子致病机理.测序结果显示,XJ-160病毒全基因组除5′末端帽子结构和3′末端多聚腺苷酸尾外共11626个核苷酸,编码3731个氨基酸.非结构基因的编码区长7464核苷酸(60nt～7523nt),编码2486氨基酸,翻译成四种非结构蛋白(nonstructural protein,nsp1-4).结构基因长3738核苷酸(7568～11306),编码1245个氨基酸,翻译成三种结构蛋白和两个小分子肽(capsid,E1-3、6k).病毒基因组5′末端和3′末端及结构基因和非结构基因之间分别有59个核苷酸、45个核苷酸和323个核苷酸的非编码区.核苷酸序列分析表明,XJ-160病毒具备典型的甲病毒属辛德毕斯病毒基因组特征,与标准辛德毕斯病毒AR339病毒株相比,核苷酸序列存在18%差异,氨基酸差异为8%.这是我国完成的第一株辛德毕斯病毒全基因组序列测定,序列已输入国际基因库(GenBank AF103728).
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辛德毕斯病毒复制子载体系统的构建
XJ-160病毒是我国分离的一株辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV),隶属于披膜病毒科(Togaviridea)甲病毒属(Alphavirus)[1,2].
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辛德毕斯病毒结构蛋白基因对宿主细胞影响的初步研究
目的 了解辛德毕斯病毒基因结构与功能的关系，阐明其分子致病分子机理。方法 构建了辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)结构基因的真核表达质粒，pcDNA3.1ABC，转染BHK-21细胞后观察其对宿主细胞的影响。结果 转染病毒结构基因的BHK-21细胞，可以发生辛德毕斯病毒感染所出现的细胞毒性反应，表现为：细胞存活率降低；细胞核染色质浓缩、凝集；G1期细胞减少、而处于s期的细胞增多。结论 辛德毕斯病毒结构蛋白基因可引起宿主细胞的凋亡。
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E基因在辛德毕斯病毒与辛德毕斯样病毒细胞感染特性中的作用
目的 寻找辛德毕斯病毒(YN87448病毒)与辛德毕斯样病毒(XJ-160病毒)对细胞感染特性差异的分子基础.方法 生物信息学比较两种病毒糖蛋白基因一级结构及二级结构,分析二者之间的差异,并利用病毒基因重组等现代分子生物学技术构建重组病毒来研究糖蛋白基因在病毒感染细胞特性中的贡献.结果 生物信息学分析显示,YN87448病毒和XJ-160病毒基因组分别具有11 717和11 626核苷酸序列,具有相同的基因组结构特征;两种病毒E基因氨基酸的疏水性主峰基本相同但存在82个散在分布的氨基酸差异位点.病毒基因重组研究结果显示,将XJ-160病毒E基因替换为YN87448病毒E基因的重组病毒(XJ-160/YE1E2)无论在致细胞病变时间,空斑形成直径,还是在病毒功能蛋白的表达等方面均完全体现YN87448病毒特征,而与XJ-160病毒野毒株的表现完全不同.结论 E基因在辛德毕斯病毒与辛德毕斯样病毒细胞感染特性差异方面起着重要作用,这一结果为从分子生物学角度解释两病毒间生物学差异提供了分子生物学理论依据.
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1株辛德毕斯病毒基因组编码区序列测定及分析
目的:对保存的一株辛德毕斯病毒基因组编码区序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的差异.方法:对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,采用DNA Star软件将分段测序结果拼接得到全长编码区序列.结果与结论:此株辛德毕斯病毒基因组编码区全长11 322 nt,编码3 774个氨基酸,其中非结构基因长7 539 nt,编码4种非结构蛋白NSp1,NSp2,NSp3,NSp4;结构基因全长3 735 nt,编码5种结构蛋白E1,E2,E3,6K和C蛋白.非结构基因和结构基因之间有48 nt的不翻译连接区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与HRsp株的同源性高,两者核苷酸序列同源性为99.7%,氨基酸序列同源性为99.6%.此株病毒与HRsp株病毒亲缘性高,同属于南非-欧洲组.
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辛德毕斯病毒病的流行病学研究概况
报告辛德毕斯病毒(Sindbis virus)的分类地位、理化特性、生物学特性和致病性.阐述了辛德毕斯病毒感染的传染源、传播途径、传播媒介、易感人群和流行特征的流行病学.浅析了辛德毕斯病毒感染的发病机制.记述了辛德毕斯病毒感染的临床表现、诊断与鉴别诊断、预防和治疗,为进一步研究和防治工作提供了科学依据.
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小白鼠经口感染辛德毕斯病毒的研究
辛德毕斯病毒经口途径可使小白鼠感染,并能在体内繁殖,经短期的病毒血症,侵入中枢神经系统.在脑、心、血、肺、肝、肾、胃、肠和脾等脏器内分离到病毒,其中脑内病毒量高.此外,经腹腔和皮下途径,亦可使小白鼠感染辛德毕斯病毒.
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虫媒病毒:一个亟待开展研究的领域
本文从病毒分离、血清学调查、发病特征及临床表现、媒介和宿主、分子生物学及分子流行病学方法等方面叙述了国内外虫媒病毒的研究近况,重点介绍了辛德毕斯病毒、环状病毒及其在福建的研究进展,阐述了开展虫媒病毒研究的紧迫性.
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首次从云南蚊虫分离到辛德毕斯病毒及其鉴定
目的 了解云南省虫媒病毒的存在和流行情况.方法 2005年8月,在云南省勐海县采集蚊虫,蚊虫标本经研磨后,上清液接种BHK21细胞以分离病毒,用间接免疫荧光试验和RT-PCR等方法 进行鉴定,并对病毒的分子生物学特征进行分析.结果 采集到蚊虫标本9 400只,其中分离到一株对BHK-21细胞能产生明显细胞病变的病毒(MX10).该病毒经间接免疫荧光试验提示为甲病毒.用甲病毒属特异引物和Sindbis病毒E1基因特异引物对MX10病毒的RT-PCR扩增为阳性,经核酸序列测定分析证实该序列与Sindbis病毒泰国分离株(AF492770)同源性高,为90.0%;与1987年分离自云南发热患者的YN87448株和1991年新疆按蚊分离株XJ-160的同源性分别为73.1%和72.0%.结论 本次从勐海县蚊虫分离到的MX10病毒株为Sindbis病毒,并可能是Sindbis病毒的新亚型或新株系.
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云南首次分离到辛德毕斯(Sindbis)、巴泰(Batai)和Colti病毒
目的了解云南省虫媒病毒分布情况,为防治提供依据.方法在云南省思茅地区和西双版纳州采集蚊虫以及发热病人血清,液氮冻存.标本常规处理,接种C6/36细胞和乳鼠以分离病毒,并用血清学和分子生物学方法对分离到的病毒进行鉴定.同时采集发热病人和健康人血清,用ELISA和血凝抑制试验检测病毒抗体.结果从西双版纳发热病人血清中分离到1株辛德毕斯(Sindbis)病毒,从澜沧县菲律宾按蚊中分离到1株巴泰(Batai)病毒,从思茅市翠云区和澜沧县三带喙库蚊、中华按蚊、菲律宾按蚊、迷走按蚊等蚊虫中分离到10株Colti病毒.血清抗体检查,西双版纳发热病人血清中辛德毕斯病毒抗体阳性率为2.50%(3/120),巴泰病毒抗体阳性率为4.17%(5/120);思茅和西双版纳地区健康人血清中辛德毕斯病毒抗体阳性率为1.93%(11/571),其中澜沧、思茅、景洪、勐腊和勐海的阳性率依次为4.55%(6/132)、0.89%(1/112)、1.25%(2/160)、1.96%(2/102)和0.00%(0/65);西双版纳发热病人和脑炎病人血清中还检测出Colti病毒抗体.结论云南省分布有经蚊虫传播的辛德毕斯、巴泰和Colti病毒,当地人群中也存在该病毒自然感染.今后应加强这3种虫媒病毒病的调查研究和防治工作.
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XJ-160病毒复制子型表达载体的构建
XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.
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云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究
本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验、耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血凝特性、空斑和毒力等试验研究，结果符合披膜病毒科的病毒特性。交叉血抑试验和免疫荧光试验，以及空斑减少中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒。其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符，纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义，其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。
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辛德毕斯病毒基因组结构与功能研究进展
辛德毕斯病毒(Sindbis virus, SINV)属于披膜病毒科(Togaviridea)甲病毒属(Alphavirus),为甲病毒属的代表株.1952年首次分离于埃及尼罗河三角洲辛德毕斯地区库蚊中,国际将首次分离的AR339株作为SINV的标准株.
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噻唑橙光化学法对血浆中病毒灭活作用的研究
目的 探讨噻唑橙(TO)光化学法对血浆中伪狂犬病毒(PRV)和Sindbis病毒的灭活效果.方法 配制TO-血浆溶液并测量其吸收光谱,制作照射光源；以PRV和Sindbis病毒为指示病毒,加入血浆以模拟病毒污染血浆；测量病毒灭活动力学曲线；做TO浓度(C)、光照强度(C)、光照时间(T)三因素三水平正交试验(n=4)以确定优灭活条件；验证优条件下裸照、血袋充氧前后的病毒灭活效果.结果 TO-血浆大吸收峰位于476 nm处；病毒灭活动力学曲线显示:在T0 60 μmol/L、光强1.06E-01 w·m-2·nm-1条件下,时间5min,即可将血浆中绝大多数病毒灭活,此后进入平台期；正交试验显示:血浆中PRV及Sindbis病毒优灭活条件均为:I=1.33E-01 w·m-2·nm-1,T =20 min,C=80 μmol/L.在此条件下,灭活效果为裸照PRV≥6.13 LogTCID50(n=8),Sindbis病毒为(5.86±0.29) LogTCID50(n=8)；血袋PRV (5.66±0.29) LogTCID50(n=4),Sindbis病毒(3.88±0.25) LogTCID50(n=4)；充氧血袋PRV(6.32±0.55) LogTCID50(n=4),Sindbis病毒(6.00±0.35) LogTCID50 (n =4).结论 TO光 化学法可有效灭活血浆中病毒,氧含量的增加可以提高病毒灭活的效果.
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短波紫外线灭活血小板中病毒的实验研究
目的 建立短波紫外线(UVC)对血小板悬液中伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒灭活的实验方法,探讨UVC法对血小板计数的影响.方法 以伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒为试验病毒,Vero细胞为培养细胞,用病毒感染细胞,制备病毒增殖液;用SSP+盐溶液替代血浆重悬血小板;含不同浓度核黄素的血小板SSP+悬液分别以不同辐照剂量的UVC照射,通过细胞感染试验评价灭活效果,筛选佳灭活条件.用血液细胞分析仪测定UVC处理前后血小板的计数.结果 短波紫外线对血小板病毒灭活作用显著,单面辐照强度为4.32 mw/cm2,照射30 s能使血小板SSP+悬液中伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒滴度均下降超过4个对数级;照射1min,伪狂犬病毒全部灭活(下降5.38个对数级),辛德毕斯病毒全部灭活(下降4.59个对数级),UVC处理后血小板计数明显下降,P＜0.05;UVC联合核黄素,在相同的照射时间下,添加核黄素组与单独使用UVC组对病毒滴度降低不明显,差异无统计学意义.在辐照剂量相同的条件下,添加核黄素组血小板计数降低较无核黄素组降低缓慢,两两比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 UVC法可有效灭活血小板中伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒;SSP+盐溶液替代血浆重悬血小板进行UVC照射,能大大缩短病毒灭活时间,提升灭活效果;UVC联合添加核黄素对病毒灭活没有明显的协同作用,但提示对血小板有一定的保护作用.
