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亚甲蓝光敏法对人血浆中病毒的灭活研究
向人血浆中加入1μmol/L亚甲蓝,以10000 lx强度的溴钨灯光照射5 min,可灭活106.5TCID50的水泡性口炎病毒与107.TCID50的辛德毕斯病毒;作用2 min可灭活10509 TCID50的人免疫缺陷1型病毒.但作用60 min仍不能破坏HBsAg抗原性.
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油酸钠与紫外线联用灭活血浆中病毒的研究
采用细胞感染法,对油酸钠与短波紫外线(UVC)联用灭活血浆中病毒进行了研究.结果,3 200μW/cm2UVC与3.0 mg/ml油酸钠联合作用30 min或3 200μW/cm2UVC与2.0 mg/ml油酸钠联合作用40 min,可使血浆中水泡性口炎病毒(VSV)滴度下降6.33～6.44 lg TCID50°,辛德比斯病毒滴度下降6 09～6 34 lg TCID50°且两者联用协同系数(T/E)远大于1,有明显增效作用.但该方法使M1 3噬菌体和f2噬菌体滴度下降≤3 lg PFU.用RT-PCR扩增VSV编码N蛋白的一段核酸,研究此消毒方法对VSV核酸的影响.结果,经UVC照射的含VSV血浆目的片段扩增阴性,油酸钠处理的含VSV血浆扩增阳性.表明UVC照射作用于VSV核酸,使之断裂,从而灭活病毒,而油酸钠对VSV的这段核酸无破坏作用.
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糖类蛋白保护剂对热力灭活冻干IgG制品中病毒的影响
采用80℃和100℃干热灭活冻干蛋白制品中的病毒时,冻干品中的糖含量(作为蛋白保护剂)≤10%,对病毒灭活效果影响较小;糖含量≥20%,热处理后的冻干蛋白剂型变化明显.
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荧光与亚甲蓝联用对血浆中病毒灭活的研究
以细胞感染试验、凝血法、交叉免疫电泳等技术,观察荧光与亚甲蓝联用对血浆中水泡性口炎病毒(VSV)和辛德比斯病毒(SV)的灭活效果及血浆蛋白的变化.结果,向盛装在聚氯乙烯袋内的血浆中加1 μmol/L亚甲蓝并经荧光(30 000 Lux)照射30 min,可将血浆中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV灭活.消毒后,血浆中的Ⅷ:C、Ⅸ:C、纤维蛋白原的回收率>75%,白蛋白、球蛋白的回收率>85%,蛋白免疫原性无变化.
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油酸钠与紫外线及维生素C灭活水泡性口炎病毒的试验观察
采用细胞感染法,对油酸钠、短波紫外线(UVC)、维生素C(Vit C)灭活水泡性口炎病毒(VSV)的作用进行了试验观察.结果,当油酸钠含量为2.0～3.0 mg/L,作用温度为4～37℃时,随着油酸钠含量和温度的提高,VSV滴度下降值由1.17 1gTCID50增至4.50 1g TCID50;而作用时间在0.5～2 h之间变化,对病毒灭活效果无明显影响.UVC照射剂量为25 500～204 000 J/m2,可使VSV下降2.39～5.00个对数滴度,剂量-效应关系为指数函数关系.Vit C对VSV无明显灭活作用.
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臭氧水对水泡性口炎病毒灭活效果的检测
经检测,在20～26℃室温下,浓度为5.0±1 mg/L的臭氧水溶液,作用30 s,可灭活悬液中水泡性口炎病毒;用其冲洗、作用1 min,可灭活干燥于玻璃片上的水泡性口炎病毒.
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松栀丸对动物诱生干扰素的实验研究
目的:将松栀丸开发成治疗慢性丙型肝炎的新药,探讨该药的作用机制.方法:选用4周龄小鼠,2月龄大鼠进行干扰素诱生实验.结果:给药后,松栀丸各剂量组干扰素含量均高于空白对照组或模型组(P＜0.01).结论:松栀丸对实验小鼠、大鼠均有诱生干扰素的作用.
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溶癌水泡性口炎病毒体外诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制
目的:研究一株实验室减毒水泡性口炎病毒(VSV)对HepG2细胞的凋亡诱导作用,并探讨其可能的作用机制.方法:首先将水泡性口炎病毒以1.0感染复数(MOI)的接种密度感染HepG2细胞,同时设接种相同体积培养液的Mock感染组,在不同时间点收集细胞,MTT法检测细胞增殖活性;AO/EB结合Hoechst/PI染色观察细胞凋亡形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测早期凋亡细胞数目;PI染色结合细胞周期分析sub-G1凋亡峰值:JC-1染色测定细胞线粒体跨膜电位(△Ψ)水平;比色法检测caspase-3,caspase-8及caspase-9的活性变化.结果:减毒VSV感染HepG2细胞后,随着感染时间的增加,HepG2细胞存活率明显降低.VSV感染HepG2细胞24h后,早期凋亡细胞数高于Mock感染组(26.46%±6.01%vs4.86%±2.28%,t=-5.817,P＜0.01);sub-G1峰细胞数高于Mock感染组(14.07%±3.83%vs 3.99%±1.36%,t=-4.293,P＜0.05);HepG2细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)明显降低(t=-4.586,P＜0.05);caspase-9和caspase-3的活性显著升高(P＜0.05或P＜0.01).结论:人肝癌细胞HepG2是VSV敏感细胞株,VSV感染HepG2导致细胞线粒体△Ψm下降,激活caspase-9进而活化下游caspase-3,终通过内源性线粒体通路诱导细胞凋亡.
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水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析
目的对水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因进行PCR扩增、克隆和序列分析.方法将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T载体中,构建N基因重组质粒载体.进行PCR及限制性内切酶分析,筛选获得N基因插入的阳性克隆.经核苷酸序列分析,并与Genbank中的VSV编码核衣壳蛋白N基因序列进行比较.结果该序列与VSV New Jersey型的09/82-HD-B株同源性高,核苷酸和推测氨基酸的同源性分别为98.9%和98.8%,有13个核苷酸差异,伴有5个氨基酸改变,第72位的酪氨酸变为组氨酸,第89位的缬氨酸变为异亮氨酸,第183位的天冬氨酸变为天冬酰胺,第205位的苯丙氨酸变为亮氨酸,第418位的丙氨酸变为缬氨酸;与Indiana型各株的同源性较低,与Glasgow株相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别为67.9%和716%.结论已成功地克隆了水泡性口炎病毒N基因,为水泡性口炎免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.
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水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性
目的 构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性.方法 利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基凶,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Western blot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/C小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平.结果 构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体.结论 该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗.
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减毒水泡性口炎病毒诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡及其作用机制
目的:研究减毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)对宫颈癌HeLa细胞的凋亡诱导作用,并探讨其可能的机制.方法:将减毒VSV以1.0 MOl的接种密度感染HeLa细胞,在6、12、18、24和30 h后收集细胞,MTT法检测HeLa细胞的增殖;AO/EB染色观察HeLa细胞凋亡形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测HeLa细胞早期凋亡率,流式细胞术分析HeLa细胞sub-G1凋亡峰,JC-1染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平,caspase试剂盒检测HeLa细胞caspase-3、caspase-8及caspase-9的活性.结果:减毒VSV感染HeLa细胞12和24 h后,HeLa细胞增殖活力分别为(78.4±1.9)%和(63.1±5.6)%(P＜0.01);早期凋亡细胞率分别为(16.88±2.48)%和(31.9±4.24)%(P＜0.01),sub-G1凋亡峰分别为(14.85±1.48)%和(21.05±2.28)%(P＜0.01).随着减毒VSV感染时间的增加,HeLa细胞线粒体跨膜电位逐渐降低(P＜0.05),caspase-9和caspase-3的活性显著升高(均P＜0.05).结论:减毒VSV能够抑制HeLa细胞的增殖,并通过caspase-9和caspase-3依赖的途径诱导HeLa细胞凋亡.
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水泡性口炎病毒的鉴别诊断技术
水泡性口炎是由水泡性口炎病毒所引起的高度接触性传染的病毒性疾病.本文就国内外近年来水泡性口炎病毒的鉴别诊断技术进行了概述.
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新基因AY358935的生物信息学分析及功能预测
目的 对新基因AY358935的功能性质进行生物信息分析,为深入研究该基因功能奠定基础.方法 利用生物信息学分析软件,分析新基因AY358935及其编码蛋白的性质、定位、结构、表达谱等特征,并根据相关信息预测其生物学功能.利用Western blotting检测病毒感染早期AY358935的表达变化.结果 AY358935基因进化保守,与马、小鼠、斑马鱼、非洲爪蟾的相似性分别为74%、60%、38%、33%.亚细胞定位于线粒体的可能性大.含有一个N末端信号肽序列和单次跨膜结构,多个磷酸化位点,二级结构主要是α螺旋和无规则卷曲.在正常组织和癌组织表达广泛,并受双链RNA依赖蛋白激酶的表达调控.AY358935蛋白表达在水泡性口炎病毒感染2h后即明显上调.结论初步预测AY358935为具有重要功能的小分子分泌蛋白,可能参与细胞增殖和抗病毒天然免疫调控.
关键词： AY358935 生物信息学 分泌蛋白 双链RNA依赖蛋白激酶 水泡性口炎病毒 -
HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)NS5A的表达对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响.方法:将稳定转染的HeLa-NS5A和HeLa-NS5A-ΔISDR细胞在6孔培养板中培养24h后,加入人基因工程α2a型干扰素(rHuIFN-αt2a)至所需浓度.培养24h后加入VSV,继续培养相应时间.取培养上清液,按10-1稀释,50μL稀释液加入含Vero细胞的24孔培养板中.每孔加入含100 mL/L小牛血清的DMEM-7.5g/L羧甲基纤维素钠(CMC)1 mL.继续培养48 h后移走培养液,结晶紫染色,自来水轻柔洗净,记录噬斑形成单位(PFU).结果:干扰素(IFN)浓度为1×105 U/L,VSV对HeLa-NS5A细胞的致病变作用要比对HeLa-NS5A-ΔISDR细胞的致病作用更明显.在整个IFN浓度处理中,HeLa-NS5A细胞培养液中的病毒滴度是HeLa-NS5A-ΔISDR细胞培养液中的病毒滴度的2～5倍(P＜0.05).结论:NS5A能增强IFN敏感病毒的复制,HCVNS5A内的ISDR可能是造成IFN对HCV患者治疗效果的因素.
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汉滩病毒包膜糖蛋白假病毒的构建及特性研究
目的：研究汉滩病毒包膜糖蛋白与宿主细胞作用的分子机制，构建含有汉滩病毒（ HTNV）标准株76～118株包膜糖蛋白的假病毒，并对其进行检测。方法：将表达汉滩病毒包膜糖蛋白的质粒和以VSVΔG为骨架的假病毒颗粒，与293T细胞共转染，构建汉滩病毒的假病毒，用中和实验，受体抑制实验，免疫共沉淀和Western Blot对其抗原性、中和反应、受体作用等进行检测。结果：汉滩病毒假病毒与活病毒有相似的抗原特性，汉滩病毒假病毒可以模拟活病毒进入细胞的方式，其糖蛋白是以二聚体形式存在的。结论：成功构建含有汉滩病毒标准株包膜糖蛋白的假病毒，它与活病毒的抗原特性和受体作用的方式相似，这为进一步研究汉滩病毒包膜糖蛋白与宿主细胞作用的分子机制提供了很好的工具。
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水泡性口炎病毒载体共表达的热休克蛋白70可以增强抗人诺瓦克病毒的黏膜免疫
作为病原体，人类诺瓦克病毒（ NOV ）占全球非细菌性胃肠炎的95％。目前，没有可用于对抗人类NOV病毒的疫苗，因为它不可培养，而且缺乏小动物模型。近研究表明，表达人类NoV 衣壳蛋白（rVSV-VP1）的重组水泡性口炎病毒（rVSV）在小鼠体内引起强烈的免疫应答。为了进一步改善候选疫苗的安全性和有效性，热休克蛋白70（HSP70）被插入到rVSV-VP1骨架载体。作为双重插入，萤火虫荧光素酶（ luc）基因插入到HSP70，形成第二构建物。相比 rVSV-VP1，所得到的重组病毒（ rVSV-HSP70-VP1和rVSV-luc-VP1）在小鼠体内的细胞繁殖和病毒传播有所衰减。在接种剂量为1．0×106 PFU时，相对于 rVSV-VP1， rVSV-HSP70-VP1触发了显著增高的阴道IgA应答；相对于rVSV-luc-VP1，诱导显著加强的粪便和阴道IgA 应答，尽管血清IgG和T细胞的应答是相似的。在接种剂量为5．0×106PFU 时，rVSV-HSP70-VP1比rVSV-VP1刺激显著增高的T 细胞应答，粪便及阴道 IgA 应答。当rVSV-VP1和rVSV-HSP70构成联合疫苗时，粪便和阴道IgA应答也显著上升。总的来说，这些数据表明：（ⅰ）插入一个附加的基因（ HSP70或 luc ）到rVSV-VP1骨架，可以进一步衰减以VSV为基础的疫苗在体外和体内的毒性，从而提高了候选疫苗的安全性；（ ii ） HSP70增强基于VSV的人NOV疫苗引发的人类NOV病毒特异的黏膜和T细胞的免疫。
