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EGFR靶向抗体融合蛋白激活免疫细胞杀伤肝癌细胞Huh7的研究
目的 探究靶向表皮生长因子受体(EGFR)的抗体西妥昔单抗(Cetuximab)与MHC-I(major histocompatibility complex-I)相关抗原分子MICB (MHC class I-related chain molecules B)的融合蛋白对肝癌细胞Huh7的杀伤效果.方法 通过重叠PCR(polymerase chain reaction)的方法通过柔性肽G4S将西妥昔单抗重链C末端及人MICB胞外区基因连接,构建成工程载体,并通过毕赤酵母进行表达;流式检测融合蛋白对Huh7细胞的结合能力;噻唑蓝(MTT)法检测Huh7细胞的增殖抑制;通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验验证融合蛋白是否能激活NK细胞杀伤肿瘤细胞.结果 通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得融合抗体蛋白,经Western blot鉴定结果说明融合蛋白Cetuximab-MICB表达及装配正确.流式细胞术检测Cetuximab-MICB与肝癌细胞Huh7的结合率为72.8％,与母体西妥昔单抗结合率(75.5％)相当.细胞增殖抑制实验,与PBS组对照相比,西妥昔单抗、融合蛋白组对肝癌细胞Huh7均有抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性.在蛋白浓度为400 nmoL/L时,Cetuximab-MICB融合蛋白组抑制率(66.09％)强于西妥昔单抗组(56.54％).将免疫细胞PBMC(peripheral blood mononuclear cell)/NK92和肿瘤细胞Huh7共孵育,通过检测LDH(lactate dehydrogenase)的释放,发现融合蛋白比西妥昔单抗更有效地介导NK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤,以PBMC为效应细胞,效靶比为100:1时Huh7细胞裂解率可以达到43.58％,优于西妥昔单抗组(37.77％).以NK92细胞为效应细胞,效靶比为10:1时Huh7细胞裂解率可以达到61.29％,明显优于西妥昔单抗组(40.54％).结论 采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了Cetuximab-MICB融合蛋白.Cetuximab-MICB融合蛋白具有良好的体外抗肿瘤活性,有效的抑制肿瘤细胞Huh7的增值,并能进一步通过NKG2D途径激活NK细胞加强免疫系统对肿瘤的免疫监视,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景.
关键词： 表皮生长因子受体(EGFR) MHC-I相关抗原分子B 融合抗体 肝癌 增殖 ADCC -
ADCC相关免疫细胞预测单克隆抗体抗肿瘤疗效研究进展
目的 随着单克隆抗体在临床的广泛应用和新型抗体的不断问世,引发了人们对其疗效和作用机制的进一步探讨.近年来研究发现,肿瘤免疫微环境中的免疫细胞可以通过介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-de-pendent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)在单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的诸多环节中发挥重要作用.本研究总结国内外报道的ADCC相关的不同免疫细胞水平与单克隆抗体疗效的相关性的研究进展.方法 以"免疫细胞、单克隆抗体、ADCC和肿瘤"等为关键词,检索PubMed、CNKI数据库和百链数据库2011-05-2017-05的相关文献.纳入标准:ADCC效应,具有ADCC作用的单克隆抗体,可以预测单克隆抗体疗效的ADCC相关免疫细胞.排除标准:2011-05之前的文献,目前没有证据表明具有ADCC作用的单克隆抗体.根据纳入和排除标准,终纳入36篇文献.结果 研究表明,多种单克隆抗体可以凭借ADCC效应在靶向治疗的基础上进一步对肿瘤细胞进行免疫杀伤.ADCC在机体的免疫微环境中发生.与ADCC相关的免疫细胞包括自然杀伤胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞和髓样抑制性细胞等.其中自然杀伤细胞、M1型巨噬细胞、CD8+T细胞、Vγ9Vδ2T细胞和中性粒细胞为具有正向免疫调节作用的生物标志物,所以相应水平升高可以预测单克隆抗体有好的疗效.M2型巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞及髓样抑制性细胞为具有负向免疫调控作用的细胞,这些细胞可以相互协作抑制肿瘤微环境中正常免疫反应的进行,导致肿瘤的进展和免疫逃逸.所以抑制相应负调控免疫细胞的水平或功能可能会预测单克隆抗体有好的疗效.结论 对于具有ADCC作用的单克隆抗体,推荐通过调节机体相关免疫细胞的水平或将单克隆抗体与ADCC增强免疫细胞调节剂相结合来增强单克隆抗体的疗效.
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基于报告基因的抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立
利用Jurkat/NFAT-luc+ FcγRⅢa转基因细胞系作为效应细胞,WIL2-S细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BioGloTM Luciferase Assay System)进行抗CD20单抗的ADCC生物学活性检测,并对实验条件进行优化及方法学验证.结果显示抗CD20单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D.方法经优化确定靶细胞为WIL2-S细胞,抗体稀释浓度为18 000 ng·mL-1,1:5倍的稀释倍数,效靶比为6∶1,诱导时间为6h.该方法具有良好的专属性,8次独立实验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验;4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(44.39±3.93)％、(72.74±2.78)％、(128.28±7.01)％和(168.19±2.70)％,变异系数均小于10％,对应回收率分别为(88.78±7.85)％、(96.99±3.70)％、(102.63±5.61)％和(112.12±1.80)％.本研究利用转基因细胞法成功建立抗CD20单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法.
关键词： 抗CD20单克隆抗体 ADCC 生物学活性 -
细胞增殖法检测单核/巨噬细胞ADCC效应方法的建立
目的:为了建立一种供临床实验室广泛应用的检测单核/巨噬细胞ADCC效应的实验方法.方法:选择CTLL2细胞作为靶细胞,制备出兔抗CTLL2细胞特异性抗血清,用单核细胞作为效应细胞,通过CTLL2细胞增殖结果检测单核细胞ADCC效应,并与传统检测方法125I-UdR释放试验进行比较.结果:该方法较同位素试验方法更敏感.结论:细胞增殖法检测单核细胞ADCC效应准确、可靠.
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IL-2增强Herceptin介导肿瘤杀伤的作用
为探讨乳腺痛患者外周血单个核细胞(PBMC)介导LAK样杀伤作用和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒)作用下降的机制,观察IL-2增强乳腺癌患者PBMC介导杀伤作用的效果.应用MTT法检测LAK样杀伤作用;应用非核素细胞毒试剂盒(LDH释放法)检测ADCC杀伤作用;应用流式细胞术检测CD3~+CD8~+ T细胞、CD3~-CD56~+NK细胞水平和CD16ζ的表达.结果显示:进展期乳腺癌患者PBMC中CD3~+CD8~+ T细胞,CD3~-CD56~+NK细胞及其CD16ζ的表达水平与健康对照组相比明显降低,有统计学意义(P<0.01).进展期乳腺癌患者PBMC经IL-2(1 000 U/ml)处理5 d后,CD3~+CD8~+ T细胞和CD3~-CD56~+NK细胞比例明显增加,CD16ζ的表达水平明显提高.在各效靶比时,IL-2处理后进展期乳腺癌患者PBMC对SKBR3细胞的LAK样和ADCC杀伤率明显高于未处理组,差异有统计学意义(P<0.01);提示进展期乳腺癌患者PBMC介导的LAK样杀伤活性和ADCC作用明屁削弱,CD3~+CD8~+ T细胞、CD3~-CD56~+NK细胞比例和CD16ζ的表达水平明显降低,IL-2可以刺激CD3~+CD8~+ T细胞和CD3~-CD56~+NK细胞增殖活化,促进CD16ζ的表达,增强杀伤作用.
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全人源化PD-L1单抗功能活性及其对人肺腺癌HCC827细胞毒性作用的研究
目的 初步探索自行研制的全人源化PD-L1单抗的功能活性及其对人肺腺癌HCC827细胞毒性作用的影响.方法 利用十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定阿特朱单抗及自研PD-L1单抗的纯度;以阿特朱单抗为阳性对照,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测该自研PD-L1单抗的结合活性和竞争性阻断活性;细胞阻断试验分别测定两抗体的细胞阻断活性;流式细胞术(FACS)测定人肺腺癌 HCC827细胞表面PD-L1的表达;检测两抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)效应.结果 SDS-PAGE鉴定出高纯度阿特朱单抗及自研PD-L1单抗;ELISA法检测结果显示自研PD-L1单抗、阿特朱单抗均可与人PD-L1结合并且阻断PD-L1与PD-1结合;自研PD-L1单抗及阿特朱单抗均可以阻断两细胞表面分子PD-L1与PD-1的结合,其EC50分别为0. 208 5,0. 154 8 μg/ml,在一定浓度上两者差异无统计学意义;FACS结果显示人肺腺癌HCC827细胞高表达PD-L1分子;细胞毒性实验结果表明当效应细胞与靶细胞比值一定时,自研PD-L1单抗与阿特朱单抗对人肺腺癌HCC827细胞都有强的毒性作用.结论 该自研全人源化PD-L1单抗有一定的功能活性,可通过阻断细胞表面的PD-L1与PD-1的结合而减弱T细胞受体信号,并可通过ADCC效应发挥一定的抗肿瘤作用.
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宫颈癌单克隆抗体AU14-1介导巨噬细胞对靶细胞的细胞毒作用
目的应用MTT比色法研究单克隆抗体AU14-1介导的巨噬细胞对小鼠宫颈癌(U14)细胞的杀伤效果. 方法通过检测不同数量小鼠宫颈癌U14细胞与加入四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl terazolium bromide], MTT)后形成甲臜颗粒所产生的不同吸光度(A)值,建立测定的线性关系.进而以小鼠巨噬细胞为效应细胞,应用MTT比色法测试在单克隆抗体AU14-1介导下对小鼠宫颈癌(U14)细胞的体外细胞毒作用. 结果效应细胞对于经单克隆抗体AU14-1处理的肿瘤细胞的杀伤率显著高于未经AU14-1处理的肿瘤细胞(P＜0.01). 结论当U14细胞在10～105个/孔时,活细胞数与A值呈直线相关;单克隆抗体AU14-1能通过抗体依赖细胞介导细胞毒(ADCC)发挥巨噬细胞对靶肿瘤细胞的杀伤作用,提示特异性宫颈癌单克隆抗体AU14-1介导的ADCC在治疗宫颈癌中可能是一种有潜在价值的方法.
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肿瘤浸润性自然杀伤细胞的研究进展
自然杀伤(natural killer,NK)细胞是一类独立的淋巴细胞群,它无需预先致敏即可直接杀伤靶细胞.NK细胞抗肿瘤作用主要是通过诱导靶细胞凋亡、释放效应细胞因子、介导抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)作用等途径发挥作用.
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血吸虫病人血清体外诱导杀童虫作用的观察
通过比较日本血吸虫感染病人与正常人血清体外诱导小鼠白细胞杀童虫的作用,了解抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)在血吸虫感染宿主的获得性免疫中的作用.体外诱导小鼠白细胞杀童虫作用,日本血吸虫感染病人血清,无论是成人组还是儿童组,初次感染组还是重复感染组,均明显地强于正常人血清,表明抗血吸虫特异性抗体可以诱导细胞介导的细胞毒作用.证明日本血吸虫感染宿主体内存在着ADCC机制,该机制对于抵抗再次感染具有一定的作用,是日本血吸虫获得性免疫的重要组分.
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CD80人-鼠嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用
目的:研究CD80人-鼠嵌合抗体(命名为ch-4E5)对天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用.方法:采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别;将ch-4E5分别加入到Raji及Daudi中共培养, 终浓度为10 mg/L.在培养的第0、 4、 10、 16、 24及48 h, 采用FCM检测细胞表面Fas及FasL的表达;培养至72 h, MTT法检测细胞的增殖;以人外周血PBMC为效应细胞, Raji与Daudi为靶细胞, 效靶比为20∶ 1, 加入ch-4E5, 终浓度为10 mg/L.培养至24 h, MTT法分析ADCC效应.结果:ch-4E5与Raji及Daudi的阳性结合率分别为98.6%和96.4%.ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至4 h, Raji细胞表面FasL的表达开始上调, 16 h的阳性表达率为16.8%, 与人IgG1对照组1.5%比较明显升高(P<0.01);Fas的表达从10 h起逐渐增高, 24 h达高峰, 阳性表达率为15.6%, 与人IgG1对照组4.5%比较具有统计学意义(P<0.01).Daudi的FasL及Fas的变化趋势与Raji一致.ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至72 h, 细胞增殖的抑制率分别为34.60%和32.64%(P<0.01);ch-4E5介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61%及54.42%(P<0.01).结论:CD80人-鼠嵌合抗体能够通过其Fab段及Fc段发挥双重的抗肿瘤效应.
