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Bcl-2shRNA表达载体的构建及其对HL-60细胞生长的抑制作用
目的构建Bcl-2短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列的表达载体并研究其对HL-60细胞生长的抑制作用.方法化学合成2段编码短发夹RNA序列针对Bcl-2基因66个碱基的寡核苷酸,克隆到Pgenesil-1载体的U6启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立阴性对照;然后经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用脂质体介导的转染方法将重组的RNAi质粒转入HL-60细胞后,采用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达水平;采用MTT法测定细胞增殖情况.结果重组构建的两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明66个碱基成功插入到预期位点,并且序列完全一致.转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体分别入HL-60细胞24h,其Bcl-2 mRNA表达水平均降低,但转染Bcl-2 shRNA1引起的Bcl-2 mRNA表达下降更为明显,分别与转染阴性shRNA及未转染组比较,有显著性差异(P＜0.05).MTT测定显示转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体入HL-60细胞在72、96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA、单纯脂质体组及未转染组比较,差异有显著性(P＜0.05).结论成功地构建了两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2表达载体,且Bcl-2 shRNA可序列特异性地抑制HL-60细胞的生长.
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PDLIM5shRNA质粒构建及其稳定转染SH-SY5Y细胞株的建立
目的 构建PDLIM5 shRNA真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的SH-SY5Y(成神经细胞瘤细胞)细胞系.方法 合成PDLIM5基因干扰序列并插到RNAi真核表达载体pGFP-V-RS质粒中,通过酶切和测序进行鉴定.常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒PDLIM5 shRNA和对照质粒PDLIM5 Scramble经脂质体Lipofectamine 2000介导转染SH-SY5Y细胞,经puromycin持续筛选和有限稀释法获得稳定转染的细胞系.RT-PCR及Western blot分别检测PDLIM5 mRNA及蛋白表达情况.结果 经双酶切及测序鉴定,重组获得的干扰真核表达质粒PDLIM5 shRNA与预期完全相同.PDLIM5 shRNA稳定转染SH-SY5Y细胞在荧光显微镜下呈亮绿色.RT-PCR及Western blot检测显示PDLIM5 mRNA及蛋白表达明显下调.结论 成功构建PDLIM5 shRNA真核表达载体及其稳定转染SH-SY5Y细胞系,为进一步研究PDLIM5在精神疾病中的功能奠定实验基础.
关键词： PDLIM5 PDLIM5 shRNA RNAi -
布氏锥虫未知CCCH-型锌指蛋白TbZC3H8功能特性的初步分析
目的 通过RNAi和蛋白复合物鉴定来初步分析布氏锥虫未知锌指蛋白TbZC3H8的特性及功能.方法 运用蛋白数据库和分析软件对TbZC3H8进行序列分析和结构域预测；构建RNAi诱导表达细胞株分析TbZC3H8经RNAi敲低后对锥虫生长的影响,并通过RT-QPCR和Western blot检测RNAi干扰效率；构建异位融合表达myc-TAP标签的TbZC3H8细胞株,采用串联亲和纯化合并质谱鉴定其蛋白复合物组成；采用免疫荧光分析蛋白定位.结果 TbZC3H8的CCCH结构域在动基体原虫中高度保守；RNAi下调TbZC3H8后明显抑制了锥虫复制；TbZC3H8蛋白复合物中包含多种未知蛋白和两种RNA结合蛋白；TbZC3H8蛋白定位于胞质中,血清饥饿和热刺激对其定位无影响.结论 TbZC3H8是锥虫生长必需的,TbC3H8与RNA结合蛋白的相互作用暗示其可能在RNA加工代谢中发挥着作用.
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慢病毒载体介导的RNAi技术构建稳定抑制β-catenin的人鼻咽癌细胞株
目的 建立稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在鼻咽癌发生中的作用提供细胞模型.方法 于β-catenin CTNNB1基因编码区选择3个siRNA靶点合成3对shRNA干扰序列,分别与pLKO.1载体连接,构建pLKO.1-sh-β-catenin质粒(干扰组1)、pLVTHM-sh-β-catenin(干扰组2)和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒(阴性对照组);将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集含慢病毒颗粒的上清液感染人鼻咽癌6-10B细胞,感染pLKO.1-sh-β-catenin和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒的细胞经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株.Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率及下游基因c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测比较细胞增殖状况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率.结果 Western blot检测结果显示pLKO.1-sh-β-catenin(干扰组1)干扰效率佳,β-catenin及c-myc蛋白表达减少;MTT检测显示干扰β-catenin后细胞吸光度下降,细胞增殖受到抑制;穿过Transwell小室底膜的细胞数:干扰组1为(23.5±4.6)个,明显低于阴性对照组(50.3±5.3,P<0.01)及空白对照组(54.3±5.6,P<0.01).结论 成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为进一步研究以β-catenin为靶点的鼻咽癌基因治疗奠定基础.
关键词： Wnt/β-catenin 慢病毒载体 RNAi 鼻咽癌 -
PPAR γ基因RNA干扰质粒的构建与鉴定
目的 构建表达细胞转录因子PPARγ的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究PPARγ参与的细胞信号通路以及PPARγ为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNA干扰质粒.方法 选取PPAR γ基因的19nt特异性序列,设计针对PPARγ的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体中,用EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将包含PPARγ基因的RNAi重组载体转染前列腺癌细胞PC-3.转染48 h后,收集细胞裂解液,Western blotting分析对照组与转染组PPARγ蛋白的表达水平.结果 双酶切证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确；含PPARγ基因的RNAi载体转染前列腺癌细胞PC-3细胞成功；Westernblotting结果显示,与空质粒对照组相比,转染组细胞PPARγ表达下调.结论 成功构建含人PPARγ基因的RNAi载体,为研究PPARγ参与的细胞信号通路提供了稳定转染的RNA干扰质粒.同时,阻断PPAR γ的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点,研究结果为以PPARγ为靶点的基因治疗提供了有利工具.
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RNA干扰抑制KATO-Ⅲ CD133阳性胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响
目的 探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增殖、侵袭、克隆球形成及化疗药物敏感性的影响.方法 通过免疫磁珠分选KATO-Ⅲ胃癌细胞中的CD133阳性细胞,将合成的CD133小干扰核糖核酸分子(siRNA)转染至KATO-ⅢCD133阳性胃癌细胞内,使用荧光标记的siRNA (FAM-siRNA)检测转染效率,通过RT-PCR、Western-blot方法检测CD133基因表达的沉默效果及上皮-间质转化(EMT)相关因子(E-cadherin、Snail和N-cadherin)的蛋白表达,采用CCK-8、Transwell侵袭实验、单克隆球形成实验和CCK-8等方法分别检测细胞增殖、侵袭、克隆球形成能力及对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性.结果 转染24 h后,转染效率可达到(87.7±8.1)％.干扰组CD133 mRNA及蛋白的表达显著低于阴性对照组(P＜0.01).转染24、48和72 h后,与阴性对照组比较,干扰组细胞的增殖活性均得到显著抑制,差异均有统计学意义(P＜0.01)；转染72 h,干扰组细胞的增殖活性较阴性对照组降低了(52.1±8.0)％.与阴性对照组比较,干扰组的细胞侵袭数减少[(41.7±6.0)比(130.3±11.0),P＜0.05],克隆球形成率降低[(24.3±4.3)％比(45.1±6.4)％,P＜0.01],Snail和N-cadherin蛋白表达降低(P＜0.01),而E-cadherin蛋白表达增高(P＜0.01).干扰组细胞对化疗药物5-FU的敏感性显著增强,5-FU对干扰组细胞的抑制率为(62.4±3.3)％,较阴性对照组的(21.5±2.2)％增加(P＜0.01).结论 CD133基因在胃癌细胞的增殖、侵袭、克隆球形成和化疗抵抗性等方面具有重要作用,可能是胃癌干细胞新型标志物,有望成为胃癌生物治疗的新靶点.
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microRNA-29s对胃癌细胞增殖和侵袭的作用
Background and Objective: MicroRNAs have emerged as post-transcriptional regulators that are critically involved in the biologic behavior of cells. This study was designed to investigate the effect of members of the microRNA-29 family on the expression of cell division cycle 42 (Cdc42) and their roles on proliferation, migration, and invasion of gastric cancer cells. Methods: We detected microRNA-29s and Cdc42 expression in gastric cancer cells by real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot analysis. Negative controlled RNA (ncontrol), microRNA-29 family members (microRNA-29a, -29b, and -29c), and Cdc42-specific small interfering RNA (si-Cdc42) were chemically synthesized and transfected into SGC7901 and BGC823 gastric cancer cells, which have a relatively low expression of microRNA-29s and a relatively high expression of Cdc42. The expression of Cdc42 and the phosphorylation of its downstream molecular PAK1 expressions were determined by Western bott analysis. Cell Counting Kit-8 was used to measure cell proliferation, and wound-healing and invasion assays were used to examine the abilities of migration and invasion. Results: Similar to si-Cdc42, the ectopic expression of microRNA-29 family members significantly reduced the expression of Cdc42 and its downstream molecular PAK1 phosphorylation levels. Consistently, ectopic expression of microRNA-29s inhibited proliferation and migration in gastric cancer cells. Invasive cell counts of the SGC7901, ncontrol/SGC7901, si-Cdc42/ SGC7901, microRNA-29a/SGC7901, microRNA-29b/SGC7901, and microRNA-29c/SGC7901 cell groups were 84.0 ±4.2, 71.7± 4.6, 16.3 ± 3.2, 15.7 ± 3.8, 16.3 ± 3.0, and 16.7± 3.1, respectively. The invasive cell counts of the BGC823, ncontrol/BGC823, si-Cdc42/BGC823, microRNA-29a/BGC823, microRNA-29b/BGC823, and microRNA-29c/BGC823 cell groups were 199.0 ± 10.5, 146.3 ±9.7, 72.7 ± 8.2, 86.7 ± 8.5, 86.0 ± 8.5, and 73.3 ± 8.3, respectively (P < 0.05). Conclusions: Members of the microRNA-29 family can obviously inhibit cell proliferation, migration, and invasion of gastric cancer cells by targeting Cdc42.
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RNAi技术的应用
RNAi技术是一种新兴的由外源性或细胞内源性的双链RNA介导的转录后基因沉默技术.通过RNAi技术,目标基因一般可以低表达或完全不表达.目前RNAi技术在基因功能、发育生物学和基因治疗方面的研究有了广泛的应用.
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RNA药物的研发现状
近年来,随着RNA新类别的发现及基因编辑技术的不断进步,对开发RNA靶向药物提供更多方向.RNA药物主要分为ASO、双链siRNAs、miRNA模拟物、RNAi、基因编辑工具引导的RNA(sgRNA).本文从这几类药物出发,阐述RNA药物研发的现状与RNA药物研发存在的难点.
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细胞角蛋白8 GFP/Puro双标干涉慢病毒系统的构建及对细胞凋亡的影响
目的：构建细胞角蛋白8（CK8）的双标慢病毒干涉载体，获得高滴度慢病毒颗粒，感染HCT116细胞建立稳定株，检测CK8敲低对细胞凋亡的影响。方法将CK8的siRNA序列插入慢病毒表达载体GV248，并与包装质粒PMD、SPA共转染293T细胞，36、48 h分两次收集慢病毒上清，应用流式细胞术检测病毒滴度。获得的病毒感染HCT116细胞，用嘌呤霉素筛选阳性细胞， Western blotting检测干涉效果。采用Annexin V/PI染色检测干涉CK8对化疗药物顺铂诱导的细胞凋亡的影响。结果与结论成功构建CK8干涉慢病毒载体并得到干涉稳定株，在HCT116细胞中干涉CK8使细胞对顺铂引起的凋亡更加敏感。
关键词： 细胞角蛋白8 GFP/Puro双标慢病毒 RNAi 凋亡 顺铂 -
siRNA干扰胰岛新生相关蛋白表达对胰岛细胞株INS-1细胞增殖的抑制作用
目的 探讨靶向胰岛新生相关蛋白(INGAP)基因RNAi对胰岛细胞增殖的抑制效应.方法 设计合成siRNA,通过脂质体转入胰岛细胞株INS-1中,研究其对靶基因的抑制效应,采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪、Western-blot法分别检测转染后的INS-1细胞中INGAP mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖.结果 结果显示siRNA6序列对细胞增殖有明显的抑制效应,INGAP mRNA及蛋白表达明显降低,INS-1细胞增殖受到抑制,P<0.05.结论 干扰INGAP基因的表达能有效抑制胰岛细胞的增殖,INGAP有可能成为治疗β细胞严重减少或损害的重要新靶点.
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RNAi下调F10基因表达对KLE细胞凋亡的影响
目的 探讨小分子双链RNA对KLE细胞中F10基因的沉默效应,并确定F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响.方法 采用体外转录法制备针对F10基因的dsRNA;脂质体转染KLE细胞,荧光定量PCR检测dsRNA转染KLE细胞不同时间后细胞中F10基因的表达水平;流式细胞仪检测F10基因沉默后KLE细胞凋亡的改变.结果 体外转录法能制备足够的dsRNA:F10基因表达水平的检测证实转染KLE细胞的dsRNA下调了F10基因表达,20 nmol/L dsRNA转染48 h的效应为显著,基因下调达到83%;20 nmol/L dsRNA转染48 h,KLE细胞凋亡百分率从0.36%增加至8.91%.结论 体外转录制备的针对F10基因的dsRNA能特异有效沉默KLE细胞中的F10基因;F10基因的表达下调可诱导KLE细胞的凋亡.
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RNA干扰人脐静脉血管内皮细胞组织因子基因表达
目的 利用RNA干扰技术沉默脐静脉内皮细胞中组织因子基因,实现瞬时沉默,为进行组织因子(TF)表达干扰的体内试验进行探索.方法 设立3种处理方法:①空白未干扰;②假干扰;③RNA干扰,每种实验方法各有3个样本.将合成的人组织因子基因(NM 001993)干扰片段shRNA序列,扩增、提取、测序正确后,转染至人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),分别对3种处理方法后TF基因沉默前后mRNA的表达采用Gel-Pro Analyzer软件进行区带灰度值扫描并分析、TF蛋白水平的表达采用免疫荧光检查进行观察.结果 shRNA转染到HUVECs后TFmRNA的表达处理间差异显著,F=27.657,P=0.001,未干扰和假干扰之间没有显著性差异(P=0.103,>0.05),未干扰和干扰之间(P=0.000,<0.05)有显著性差异.空白未干扰TF免疫荧光检测呈现"满天星"的表现,在阴性对照组荧光染色略有减少,在RNA干扰组TF蛋白表达明显减少.结论 HUVECs中TF的表达被所构建的pENTRTM/U6-TF-shRNA载体明显抑制,有可能成为未来出凝血及其它疾病的新的治疗手段之一.
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ZNF217肿瘤基因shRNA表达载体的构建及鉴定
目的 构建针对ZNF217肿瘤基因的shRNA表达载体,以用于后续的RNAi研究.方法 依据设计shRNA的原则,针对人ZNF217的mRNA序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒,构建重组体PGenesil-ZNF217,进行测序鉴定,然后转染重组体至HO-8910细胞中.转染24 h后流式细胞仪检测转染率.结果 酶切及测序证实质粒PGenesil-ZNF217构建成功,转染24 h的HO-8910细胞发出绿色荧光.结论 成功构建的针对人ZNF217基因shRNA表达质粒PGenesil-ZNF217转染进人卵巢癌细胞株HO-8910细胞,为后续研究以及卵巢癌的基因治疗奠定了基础.
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基于PCR的siRNA表达框的制备
目的改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用.方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板.选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH-SY5Y细胞48h后提取RNA进行RT-PCR,检测RNA干扰的效应.结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确.细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制.结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究.
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RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究
目的运用RNAi技术,设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA),研究其干扰效果.方法针对c-myc mRNA的第1357靶位点设计siRNAs,经LipofectamineTM2000脂质体法转染K562细胞,进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测,观察其干扰效果.结果转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-myc mRNA表达明显减弱,细胞计数和MTT D(λ)值均有显著降低,并有明显的凋亡率.结论运用RNAi技术,可以有效地干扰c-myc的表达,并进一步诱导细胞凋亡.
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RNAi技术对人脑微血管内皮细胞ANXA2基因表达水平的影响
目的 研究RNAi技术对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular cells,HBMEC)ANXA2基因表达水平的影响.方法 将化学合成三对siRNA采用riboFECTTM CP转染试剂介导法转染HBMEC,应用荧光定量PCR法检测RNA干扰后ANXA2 mRNA表达量,得出抑制率.应用Westem-blot检测RNA干扰后对ANXA2蛋白表达的影响.结果 成功将siRNA转染HBMEC,荧光定量PCR吉果显示,在转染24 h后,各干扰组与阴性组比较ANXA2基因表达量明显下调(P＜0.01),Western-blot显示siRNA-ANXA2-2、siRNA-ANXA2-3转染前后ANXA2蛋白的表达水平明显受到抑制.结论 合成的ANXA2 siRNA能有效抑制ANXA2蛋白的表达、降低ANXA2 mRNA水平,对ANXA2有高效和特异的沉默作用,以ANXA2为靶点的RNA干扰技术可望成为鉴定HBMEC有关EV71膜受体的新策略.
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RNAa效应研究及应用进展
RNAa (RNA activation)是指某些新发现的反标准非编码RNA (ncRNA)在转录水平上激活目的基因表达的现象,这种发挥激活作用的小分子RNA又叫小激活RNA (saRNA),属小分子双链非编码RNA家族,其作用机制尚未完全明了,但其应用前景已引起人们的关注.该文就RNAa的效应及其应用进展进行了综述.
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RNAI在基因治疗中的应用及其设计
与基因有关的疾病众多,有的甚至是直接的因果关系.以蛋白质为靶点干预组织细胞的功能是现代医药预防和治疗疾病的基础之一.然而以传统方法改变蛋白质功能的化学药物往往特异性不高,副作用多.根据碱基配对原则以mRNA为靶点理论能高度特异地阻断蛋白质的表达,从而达到从根本上治疗疾病的目的.在过去20 a左右的时间里,反义核酸及核酶技术在这方面扮演了重要角色,然而它们封闭蛋白质表达的效果仍难于达到治疗疾病的水平.由双链RNA诱导的基因沉默现象称为RNA干涉(RNA interference,RNAi).RNAi的诞生又一次点燃了人们的希望.由于RNAi是包括人类在内的从低等真核生物到哺乳动物体内天然存在的基因沉默机制,其抑制靶基因表达的效率远比反义核酸高,持续时间也更长[1,2],因此RNAi在基因治疗中的应用可能更安全、更高效.目前,RNAi技术用于肿瘤、传染性疾病及遗传病等治疗的实验研究已经展开.本文就RNAi的设计及其在基因治疗中的应用作一综述.
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Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选
目的 构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础.方法 分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmoL/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调入nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株.结果 重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经Xho I和HPAI双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确.干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低.结论 成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础.
