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以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立与初步应用
目的建立以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的高通量筛选模型，用于胰岛新生相关蛋白基因表达上调剂的筛选。方法以叙利亚金黄地鼠基因组 DNA为模板扩增胰岛新生相关蛋白核心启动子序列，克隆至 pGL4.17质粒载体构建重组质粒。采用脂质体介导的方法将重组质粒和内参质粒 pRL-TK共转染金黄地鼠胰岛β细胞 HIT-T15，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达活性。对瞬时转染条件进行优化，以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作为阳性对照来评价模型的有效性，并利用该细胞模型对本研究所的化合物库进行筛选。结果构建了重组荧光素酶报告基因质粒 pGL4.17-INGAP，并成功转染 HIT-T15细胞株。对模型进行优化后，应用阳性对照对其进行评价，Z'因子为0.57，适用于进行高通量筛选。用该模型筛选了本所化合物库，其中白藜芦醇显示出较好的上调作用，EC50为1.6μg/ml。结论成功建立了以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型。
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人胰岛新生相关蛋白基因毕赤酵母表达载体的构建
目的 构建分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP)载体毕赤酵母.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒αINGAP/pPIC9K.电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,Western blotting鉴定目的 蛋白,ELISA法定量测定其含量.结果 重组表达质粒αINGAP/pPIC9K经酶切获得758bp片段,符合α因子与INGAP片段融合的长度,筛选得到3个阳性转化子,培养上清含有与抗INGAP抗体反应的蛋白.结论 成功构建了分泌INGAP蛋白的毕赤酵母菌株.
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胰岛新生相关蛋白调控β细胞新生
胰岛新生相关蛋白(INGAP)属于再生基因蛋白Reg3家族,胰岛新生相关蛋白肽( INGAP-pp)是其中一段具有生物学活性的15个氨基酸的片段.体内、外相关研究均表明INGAP-pp能促进胰岛再生,增加胰岛素的分泌,但其作用机制尚未完全清楚.研究表明,INGAP可能通过干扰细胞周期的调控或其他信号通路促使其由增殖转为分化,胰十二指肠同源盒因子-1( PDX-1)等多种转录因子可调节INGAP的表达.INGAP是促进胰岛新生的关键因素,探讨其作用机制和潜在的作用途径具有重要意义.
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胰岛新生相关蛋白连接的空间稳定免疫脂质体的构建和理化性质测定
目的 以肝细胞生长因子为包被对象,研究胰岛新生相关蛋白(INGAP)空间稳定免疫脂质体的制备方法 、理化性质和体外靶向性.方法 制备含PDP-PEG-HSPE的空间稳定脂质体,共价连接马来酰亚胺衍生化IN-GAP.激光散射粒度仪测定其粒径分布,比色法测定包封率,透析法检测药物释放度及累积泄漏率,ELISA法检测脂质体表面的抗体免疫活性,流式细胞仪及免疫荧光考察该免疫脂质体对ARIP细胞(大鼠胰腺导管癌细胞系)的结合活性.结果 INGAP-SIL[HGF]脂质体的粒径分布为(95.86±6.54)nm;包封率为(88.37±3.58)%;24 h释放度为(23.26±2.45)%;4 ℃保存时7 d内药物累积泄漏率小于3%;4℃和25℃条件下保存7 d,免疫活性均在75%以上;INGAP连接到脂质体表面后,其免疫活性基本保留;空间稳定脂质体能特异性地结合ARIP细胞.结论 通过PDP-PEG-HSPE共价连接INGAP制备的INGAP-SIL理化性质较稳定,能基本保留INGAP的免疫活性,具有体外靶向细胞抗原的能力.
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胰岛新生相关蛋白的口服磁性纳米微粒研究
目的 以Fe3O4、壳聚糖为载体制备口服胰岛新生相关蛋白磁性纳米微粒.方法 通过系统考察制备材料水溶液的流动性、黏稠度、稳定性等结果确定了CTS浓度为1％、植物油与CTS乳液配比为2∶8,以CaCl溶液反滴滴定法等方法为INGAP-MS制备工艺参数及程序.结果 制备出平均粒径为3.33 μm壳聚糖-Fe3O4包裹的胰岛新生相关蛋白磁性纳米微粒,其平均载药量为31.5％,平均药物包封率为91.0％.电镜观察所得MS表面光整、大小均一,体外释药实验结果显示此INGAP-MS具有良好的缓释功能,长释药时间可达到2d以上,大鼠经口服胰岛新生相关蛋白磁性纳米微粒后,其降糖作用可持续2d,空腹血糖维持正常.结论 口服胰岛新生相关蛋白磁性纳米微粒在药物的吸收相具有良好的量效关系,分别3H-TdR和FITC标记进行INGAP-MS体内靶向实验分析,发现INGAP-MS主要靶向至胰腺组织并能够被巨噬细胞吞噬,药效优于相同剂量的胰岛素注射剂(P＜0.05).
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siRNA干扰胰岛新生相关蛋白表达对胰岛细胞株INS-1细胞增殖的抑制作用
目的 探讨靶向胰岛新生相关蛋白(INGAP)基因RNAi对胰岛细胞增殖的抑制效应.方法 设计合成siRNA,通过脂质体转入胰岛细胞株INS-1中,研究其对靶基因的抑制效应,采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪、Western-blot法分别检测转染后的INS-1细胞中INGAP mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖.结果 结果显示siRNA6序列对细胞增殖有明显的抑制效应,INGAP mRNA及蛋白表达明显降低,INS-1细胞增殖受到抑制,P<0.05.结论 干扰INGAP基因的表达能有效抑制胰岛细胞的增殖,INGAP有可能成为治疗β细胞严重减少或损害的重要新靶点.
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人胰岛新生相关蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达
目的 在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物试验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的 蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K,筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达.
