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F10基因过表达对A549细胞致瘤性的影响
目的 探讨F10基因过表达对肺癌A549细胞裸鼠成瘤的影响及其机制.方法 取SPF级裸鼠(4～5周龄)18只,随机均分为A549-WT组、MockA549组和F10+A549组(n=6),依次接种野生A549细胞(A549.WT)、转染了空载体的对照细胞株(Mock-A549)和已构建的过表达F10基因的A549细胞(F10+A549)5 × 106个于颈背部皮下.接种后每3～4d称体重并观察,记录肿瘤发生时间,绘制在体肿瘤生长曲线,计算各组裸鼠的成瘤率.各组裸鼠于接种5周后处死,进行大体观察后取瘤组织块制备石蜡切片,HE染色后行病理组织学观察,并采用免疫组化法检测Caspase-3、Bax和Bcl-2在瘤组织中的表达.结果 A549-WT组、Mock-A549组和F10+A549组裸鼠的成瘤时间分别为12.0±1.4、11.7±1.0、8.5±1.4d,组间比较差异有统计学意义(F=13.523,P=0.000),A549-WT组和MocbA549组裸鼠成瘤时间长于F10+A549组(P＜0.05),而前两组比较差异无统计学意义(P=0.660).大体观察可见,F10+AS49组成瘤体积较胚49-WT和Mock-A549组明显增大.F10+A549组肿瘤的在体生长速度较A549-WT和Mock-A549组增快,差异有统计学意义(P＜0.05),而后两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).肿瘤组织HE切片显示,A549-WT和Mock-A549组成瘤组织中存在较多坏死细胞,HE染色表现为均质红染、无定形物质结构,而F 10+A549组成瘤组织边缘细胞坏死较少,细胞增生明显,且肿瘤组织局部可见微血管生成.免疫组化检测显示,Bcl-2蛋白在A549-WT和Mock-A549两组瘤组织中几乎无表达,而在F10+A549组瘤组织中表达较多,阳性细胞呈弥漫性分布.Bax和Caspase-3蛋白在A549-WT和Mock-A549两组瘤组织中的表达均较强,尤以A549-WT组为显著,但在P10+A549组瘤组织中表达均很弱.结论 F10基因可通过下调Caspase-3和Bax表达、上调Bcl-2表达而增强肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性.
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F10蛋白及mRNA在部分正常组织及癌组织中的表达
目的:了解F10基因在部分正常组织及肿瘤组织中的表达情况.方法:利用原位杂交和免疫组化方法对F10在部分正常组织和肿瘤组织中的mRNA和蛋白表达情况进行分析.结果:F10基因不仅在腺癌组织中表达呈阳性,在鳞癌组织中表现出较腺癌更强的强阳性,并且在正常组织中也有一定的表达.结论:F10是一个在多种组织普遍表达的细胞内蛋白,其功能可能与物质转运相关.
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F10基因过表达及沉默对绒癌细胞系 JAR 侵袭相关蛋白酶表达的影响
目的： F10基因是本研究前期发现在葡萄胎中高表达的新基因，本文为明确F10过表达和沉默对绒癌细胞系JAR侵袭性的影响，探讨F10基因与部分侵袭相关蛋白的关系。方法通过细胞转染技术及RNA干扰技术，分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JAR。取SPF级裸鼠30只，随机均分为F10过表达组、未处理组、F10沉默组，每组10只，依次接种F10基因过表达的JAR细胞、未处理的JAR细胞和F10基因沉默的JAR细胞株，于接种5周后处死裸鼠收获皮下肿瘤，采用免疫组织化学及Western blot检测方法，比较不同组瘤体组织中基质金属蛋白酶（ matrix metalloproteinase， MMPs）及金属蛋白酶组织抑制物-1（ tissue inhibitors of metalloproteinases-1， TIMP-1），血浆纤溶酶原激活物抑制因子（ plasmino-gen activator inhibitor-1， PAI-1）等侵袭相关蛋白酶的表达差异。结果免疫组化法检测结果显示：F10、MMP-2、8、11、16、19在F10过表达组、未处理组、F10沉默组中间的表达依次递减，差异有统计学意义（ P＜0．05），TIMP-1、PAI-1在F10过表达组中分别为0．118±0．029、0．174±0．005，在未处理组中分别为0．214±0．028、0．289±0．009，在F10沉默组中分别为0．430±0．017、0．517±0．074，3组间的表达差异有统计学意义（ P＜0．05）。 Western blot结果显示，F10、MMP-2、8、11、16、19蛋白在F10沉默组、未处理组、F10过表达组依次递增（ P＜0．001），而TIMP-1及PAI-1蛋白表达水平依次递减（ P＜0．001）。结论 F10通过上调MMP-2、8、11、16、19的表达，下调TIMP-1、PAI-1表达，参与调节绒癌细胞的增殖，从而可能参与调节绒癌的侵袭和转移。
关键词： 绒癌 F10基因 基质金属蛋白酶 血浆纤溶酶原激活物抑制因子 JAR细胞 -
葡萄胎病理相关新基因 F10重组蛋白的表达及鉴定
目的： F10是从葡萄胎组织中克隆的新基因，前期研究显示F10基因可能与滋养细胞侵袭性有关，为进一步研究F10基因功能，拟构建原核质粒表达葡萄胎相关新基因 F10重组蛋白，分离纯化并鉴定。方法用逆转录聚合酶链反应法从人组织中扩增F10基因编码序列，将其克隆到pET28a原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达F10基因重组蛋白，用层析柱予以纯化并采用SDS-PAGE电泳鉴定。结果成功构建了pET28a/F10原核表达质粒，并获得高纯度的重组F10蛋白。结论表达及纯化的重组F10蛋白纯度高，适合作为制备单克隆抗体的抗原，可用于F10功能的进一步研究。
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F10基因过表达及沉默对绒癌细胞系JEG-3侵袭性的影响
目的 探讨F10基因过表达及沉默对绒癌细胞系JEG-3侵袭相关蛋白酶表达的影响.方法 采用细胞转染技术及RNA干扰技术,分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3.将SPF级裸鼠(4～5周龄)30只随机分为F10过表达组、F10沉默组和未处理组各10只,分别接种F10基因过表达的JEG-3细胞、F10基因沉默的JEG-3细胞和未处理的JEG-3细胞.于接种5周后处死裸鼠取皮下肿瘤,采用免疫组织化学法和Western blot法检测各组瘤体组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP-1),血浆纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1,PAL-1)等侵袭相关蛋白酶的表达,并进行比较.结果 免疫组织化学结果显示,F10过表达组成瘤组织中MMP-2、MMP-8、MMP-11、MMP-16、MMP-19蛋白表达水平(0.332±0.037、0.473±0.089、0.441±0.031、0.470±0.040、0.548±0.062)高于未处理组(0.209±0.021、0.314±0.108、0.207±0.025、0.400±0.057、0.466±0.038)和F10沉默组(0.049±0.013、0.168±0.034、0.149±0.024、0.240±0.024、0.175±0.029) (P＜0.05),未处理组高于F10沉默组(P＜0.05);F10过表达组TIMP-1(0.191±0.027)和PAL-1蛋白(0.130±0.020)表达水平低于未处理组(0.249±0.036、0.284±0.020)和F10沉默组(0.310±0.018、0.463±0.115) (P＜0.05),未处理组低于F10沉默组(P＜0.05).wesrern blot检测结果显示,上述侵袭相关蛋白酶在3组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 F10通过上调MMP 2、MMP-8、MMP11、MMP-16、MMP-19表达,下调TIMP-1、PAI-1表达,促进绒癌细胞增殖、侵袭和转移.
关键词： 绒癌 F10基因 基质金属蛋白酶 血浆纤溶醇原激活物抑制因子 JEG-3细胞 -
四环素及其衍生物诱导表达的pTet-On肺癌细胞系A549的建立
目的:构建可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体统A549 pTet-On细胞系.用于F10基因的功能研究.方法:将pTet-On质粒用脂质体介导法转染A549细胞, 利用G418的药物选择特性, 对转染的A549细胞进行压力筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化, 单克隆分别扩增后, 瞬时转染pTRE-luc(编码荧光素酶蛋白)质粒, Dox诱导表达后, 检测荧光素酶活性, 逐一筛选四环素调控高表达外源基因的A549 pTet-On细胞株.结果:成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的A549 pTet-On细胞株.结论:筛选的A549细胞为F10基因表达能被pTet-on诱导表达系统调控的细胞系, 为研究F10基因功能提供了理想的细胞模型.适合在此基础上对F10基因进行深入的研究.
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F10基因沉默及过表达对绒癌细胞系JAR细胞周期的影响
目的：探讨F10基因功能与部分细胞周期蛋白表达的关系。方法选择已建立并筛选的F10基因沉默、稳定过表达绒癌细胞系JAR，以未处理JAR细胞为对照组，采用流式细胞仪检测细胞周期，Western blotting及免疫荧光细胞化学技术检测细胞周期蛋白（cyclin）和细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）的表达水平差异。结果流式细胞仪检测细胞周期显示，F10过表达组的JAR细胞细胞周期较沉默组及未处理组缩短。Western blotting检测结果显示，在F10沉默组、未处理组及F10过表达组的JAR细胞中cyclinA2、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK6、CDK7表达递增，过表达组及沉默组的蛋白表达水平与未处理组相比较差异有统计学意义（P<0.05），CDK4除外。免疫荧光细胞技术实验结果与Western-Blot检测结果基本一致。结论 F10基因通过上调细胞周期蛋白cyclinA2、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK6、CDK7的表达，加快细胞周期进程，促进细胞增殖，从而参与调节绒癌细胞的侵袭与转移。
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葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3成瘤性的关系
目的：探讨葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3裸鼠皮下成瘤的关系。方法通过细胞转染技术及RNA干扰技术，分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3。取SPF级裸鼠（4~5周龄）30只，随机均分为JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组（n=10），分别接种F10基因过表达的JEG-3细胞、F10基因沉默的JEG-3细胞和未处理的JEG-3细胞株5×107个于颈背部皮下。接种后每3~4 d称量裸鼠质量观察，记录肿瘤发生时间，观察皮下肿瘤的生长情况。绘制在体肿瘤生长曲线，计算各组裸鼠的成瘤率。结果3组的成瘤率均为100%（10/10）。JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组的成瘤时间分别为6.2±0.78、7±2.49、6.3±0.67 d，组间比较无统计学差异（F=0.781，P=0.468）。JEG-3 F10过表达组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组增快，差异有统计学意义（P<0.05），JEG-3 F10未处理组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组快（P<0.05）。细胞接种5周后处死小鼠，取瘤组织称重，JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组肿瘤重量分别为571.1±221.10 mg、136.2±66.25 mg、354.5±116.23 mg，组间比较存在统计学差异（F=21.199，P=0.000）。结论 F10基因与绒癌细胞系JEG-3的增殖调节有关，可增强JEG-3细胞系在裸鼠体内的致瘤性。
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葡萄胎发病相关新基因F10功能的初步研究
目的 研究与葡萄胎发病相关的新基因F10的功能.方法 培养A549细胞,实验分4组:正向F10基因、反向F10基因、空载体分别转染A549细胞组、空白细胞组.转染24 h提取细胞mRNA.用差异显示(DDPCR)方法筛选4组之间差异表达的基因.结果 获得差异表达的条带,二次PCR扩增后产物连接T载体并测序分析,结果与GenBank数据库中的序列进行同源比较,筛选出几个差异表达的基因,经荧光定量PCR证实annexin I(钙依赖、磷脂结合蛋白)、STATI(信号转导子与转录激活子)、BASP1在正向F10基因转染组高表达.IPLA2、DATF1在正向F10基因转染组低表达.结论 F10基因可能是与细胞增殖和凋亡相关的基因.
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RNAi下调F10基因表达对KLE细胞凋亡的影响
目的 探讨小分子双链RNA对KLE细胞中F10基因的沉默效应,并确定F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响.方法 采用体外转录法制备针对F10基因的dsRNA;脂质体转染KLE细胞,荧光定量PCR检测dsRNA转染KLE细胞不同时间后细胞中F10基因的表达水平;流式细胞仪检测F10基因沉默后KLE细胞凋亡的改变.结果 体外转录法能制备足够的dsRNA:F10基因表达水平的检测证实转染KLE细胞的dsRNA下调了F10基因表达,20 nmol/L dsRNA转染48 h的效应为显著,基因下调达到83%;20 nmol/L dsRNA转染48 h,KLE细胞凋亡百分率从0.36%增加至8.91%.结论 体外转录制备的针对F10基因的dsRNA能特异有效沉默KLE细胞中的F10基因;F10基因的表达下调可诱导KLE细胞的凋亡.
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F10基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定
目的 检测葡萄胎发病新基因F10在人多种细胞系中转录水平的表达,从中选取F10低表达的细胞株,构建F10稳定转染的表达系统,研究F10的功能.方法 荧光定量PCR检测F10在人A549、16HBE、Bel7402、HIC、HepG2、293、PC、MGC细胞株中的表达差异.采用电穿孔介导基因转染技术将已构建的pRc-CMV2-F10、pRc-CMV2转染A549细胞系.经G418筛选获得阳性单克隆细胞.细胞扩大培养后,荧光定量PCR技术鉴定F10基因在阳性克隆细胞中的表达.结果 新基因F10在人的8种细胞系中呈不同程度的表达,其中在Bel7402、PC、MGC中呈高表达,在HepG2、HIC中表达次之,293中表达量较低,16HBE、A549中表达量低;稳定转染细胞株A549具有F10基因的整合和相应mRNA的高表达.结论 成功构建了稳定表达外源新基因F10的肺癌细胞系,为进一步研究F10基因的生物学功能提供了实验材料.
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F10基因在宫颈癌组织中的表达
目的 检测F10基因及其编码蛋白在宫颈癌组织中的表达情况,探讨F10基因与宫颈癌病理发生发展的关系.方法 收集宫颈癌临床组织标本共30例,运用RT-PCR的方法检测30对宫颈癌组织及相应的癌旁组织中的F10基因的表达,运用免疫组织化学方法检测并比较30对宫颈癌组织与癌旁组织及正常组织中F10基因蛋白的表达情况.结果 RT-PCR的检测结果显示,宫颈癌组织中F10基因的表达明显高于相应癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),免疫组织化学检测F10蛋白的结果与RT-PCR结果基本一致.对不同分化程度的病例进行分析,结果显示低分化组宫颈癌组织中F10的表达显著高于中低分化或中分化病例.术前化疗的宫颈癌组织中F10的表达量降低,显著低于未行术前化疗的病例(P<0.01).结论 宫颈癌组织中F10基因的表达量与其分化程度呈负相关,分化程度越低的宫颈癌组织中F10表达越强,可能与癌症的产生与发展有关.另外,化疗显著下调宫颈癌组织中F10的表达.
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F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位
目的:构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体,进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况.方法:运用RT-PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF,构建pEGFP-N2/F10和pEGFP-C2/F10的融合表达载体,以LipofectA MINE 2000为介导剂,将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7,并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白.结果:显微镜下观察到,GFP/F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核,或细胞浆,或者在核浆中均有分布,而且在细胞浆中主要分布在细胞器中.而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核.结论:F10蛋白在细胞的不同周期分布不同,或在细胞核,或在细胞胞浆中,或者在核浆中均有分布.
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F10基因对细胞中PCNA和Cyclin D1表达的影响
[目的]确定F10基因表达对细胞生长的影响,明确F10基因的功能.[方法]构建F10基因的真核表达载体,转染重组pRc-CMV2-F10质粒于肺癌细胞系A549,筛选并获得稳定表达F10基因的细胞克隆A549-F10.通过MTT实验和流式细胞检测F10对细胞生长的影响;通过免疫组化检测细胞中增殖核扰原(PCNA)和细胞周期素D1(cyclin D1)的表达.[结果]转基因的G418抗性克隆能够检测到F10表达.MTT和流式结果显示F10有促进细胞增殖的作用.阳性克隆的细胞株中PCNA和cyclin D1相对较高水平的表达.[结论]F10基因通过上调PCNA和cyclin D1的表达,促进细胞的生长增殖.
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F10下调通过细胞色素C促进KLE细胞凋亡
目的 建立F10基因表达稳定下调的KLE细胞系.探讨F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响及机制.方法 将两条合成的寡核苷酸退火后形成的双链DNA连接到逆转录病毒载体pRetroQ上构建表达质粒pRetroQ-i F10,脂质体转染KLE细胞,嘌呤霉素筛选,获得单细胞克隆;荧光定量RT-PCR鉴定阳性克隆.流式细胞仪检测细胞凋亡,荧光定量RT-PCR和western blot检测细胞色素c和Bcl-2表达.结果 两个抗性克隆呈现F10 mRNA表达显著下调.F10基因沉默的KLE细胞克隆凋亡率较对照组增加近9倍,细胞色素C mRNA表达上调、胞浆细胞色素c表迭增加,Bel-2 mRNA和蛋白表达下调.结论 成功构建F10基因表达稳定下调的KLE细胞系,F10基因表达下调导致细胞凋亡;细胞色素C的释放可能是F10沉默诱导KLE细胞凋亡的途径之一.
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葡萄胎发病新基因F10在不同肿瘤组织的表达
目的研究葡萄胎差异表达新基因F10在不同组织的表达情况及其与恶性肿瘤之间的关系.方法采用原位杂交方法检测不同肿瘤组织和正常组织的F10基因mRNA表达.结果F10基因在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中阳性表达,不同腺癌之间阳性表达差异无显著性(P＞0.05).子宫内膜、宫颈上皮等正常组织、肝癌癌旁组织中F10基因阴性表达.结论葡萄胎差异表达新基因F10不仅与滋养细胞肿瘤密切相关,可能还在某些腺癌发生发展中起重要作用.
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F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
目的:表达F10蛋白,并制备兔抗F10多克隆抗体.方法:利用PCR方法扩增F10基因片段,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后连接入pET-GST原核表达载体,构建的pET-GST/F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化.表达产物用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定.以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗F10的多克隆抗体,并以ELISA法检测抗体效价.结果:经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示pET-GST/F10诱导后表达一相对分子质量(Mr)约为61 000的融合蛋白,与预期结果相符.目的蛋白纯化后的纯度达90%以上,Western blot证实该蛋白是GST/F10的融合蛋白.将纯化的GST/F10融合蛋白免疫家兔,得到的兔抗F10抗体效价达1:20 000.结论:成功构建了人F10基因原核表达载体,并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体,为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础.
