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基于细胞转基因平台创制抗BmNPV的细胞素材
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是影响蚕业生产为严重的病原之一,每年对我国蚕业生产方面造成很大的经济损失.通过RNA干扰技术(RNAi)干扰BmNPV的增殖关键基因可以有效地抑制病毒的增殖复制.本研究以BmNPV侵染关键基因gp64和lef-1为靶标基因,并利用病毒诱导型启动子LEF3P和39KP共构建了4种RNAi干扰表达载体,分别命名为:piggyBacA3-EGFP-39KP gp64、piggyBacA3-EG-FP-39KP-lef-1、piggyBacA3 EGFP LEF3P-gp64、piggyBacA3-EGFP-LEF3P lef-1.经瞬时转染和筛选稳定表达的家蚕细胞系抗病毒检测结果表明,通过RNAi技术能够有效的抑制病毒增殖复制,并确定了39KP启动效果优于LEF3P启动子,干扰gp64基因的抗病毒效果优于lef-1基因.这些研究结果为后期转基因品系培育和家蚕抗病毒研究提供了基础.
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胰腺实性假乳头状肿瘤临床病理特征及LEF-1在其诊断中的应用价值
目的 探讨胰腺实性假乳头状肿瘤(SPN)的临床病理特征及淋巴细胞增强因子1(LEF-1)表达在其诊断中的应用价值.方法 收集并分析长海医院2000年1月至2015年12月间病理确诊为SPN的227例患者的临床病理资料,采用免疫组织化学方法检测132例SPN中LEF-1的表达,并与诊断SPN常用的标志物β-catenin等的表达进行比较.结果 81.9%(186/227)的SPN发生于女性,发病平均年龄34岁;肿瘤平均直径为5.4 cm;48.5% SPN位于胰体尾部,33.0%位于胰头部;46.3%的肿瘤呈囊实性,42.3%呈实性,11.4%呈囊性.镜下观察有2例(0.9%)出现淋巴结转移,15例(6.6%)有脉管癌栓,14例(6.2%)有神经侵犯,13例(5.7%)侵犯邻近脏器.免疫组织化学结果显示,132例SPN中130例LEF-1呈核强阳性表达,阳性率为98.5%,而周围正常胰腺组织及胰腺其他肿瘤均未见LEF-1表达,特异性为100%.SPN的β-catenin阳性率为96.6%(144/149),但有1例腺泡细胞癌呈阳性表达,特异性降低.165例术后平均随访51个月,截止至2016年10月31日,162例(98.2%)存活,5例出现肝脏转移,1例复发.结论 SPN好发于年轻女性,临床表现无特异性.LEF-1可作为SPN诊断和鉴别诊断的特异性标志物之一,且较β-catenin更为准确.
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Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及其意义
目的 研究Wnt信号通路相关因子β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及意义. 方法 应用免疫组织化学EnVision法检测218例人卵巢组织(包括正常组织,卵巢良性腺瘤及腺癌组织标本)中β-catenin、GSK3β及Lef-1的表达情况. 结果 β-catenin、GSK3β及Lef-1在癌组织中的表达明显高于腺瘤及正常组织(P＜0.05);β-catenin及Lef-1表达与淋巴结转移及FIGO分期有关(P＜0.05),与肿瘤分级无关(P ＞0.05);GSK3β与肿瘤分级、淋巴结转移及FIGO分期有关(P＜0.05);β-catenin、GSK3β及Lef-1三者在癌中的表达均与卵巢癌的类型无关(P＞0.05).β-catenin表达与GSK3β和Lef-1表达均呈正相关(P＜0.05). 结论 Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及LEF-1在卵巢癌的发生发展过程中起了一定的作用,卵巢癌的进展可能和β-catenin分别与GSK3β及LEF-1共同作用促进细胞的增殖有关,三者高表达与卵巢癌的预后有关.
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流体剪切力对成骨细胞LEF-1蛋白表达的影响
目的:探讨MC3T3-E1细胞在流体剪切力作用下LEF-1的表达.方法:通过流体剪切加载系统对MC3T3-E1爬片细胞施加12dyn/cm的流体剪切力,分别作用0h,2h,4h,8h,12h,用RT-PCR方法检测细胞受力前后LEF-1 mRNA表达的变化;应用免疫荧光双标记法检测不同时间点流体剪切力作用下MC3T3-E1细胞中的LEF-1 mRNA表达改变.结果:RT-PCR和免疫荧光双标记法的结果表明12dyn/cm 8h流体剪切力作用下的MC3T3-E1细胞LEF-1 mRNA的表达较其它各组明显增强.结论:通过流体剪切力力学刺激,激活了成骨细胞LEF-1/TCF1转录活动,LEF-1 mRNA的表达增强可能是成骨细胞经典Wnt信号通路对剪切应力的应答反应.
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LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究
目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,
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AEG-1和LEF-1在人结肠癌组织中的表达及其意义
目的：探讨星形胶质细胞上调基因-1（AEG-1）和淋巴增强因子-1（LEF-1）在人结肠癌组织中的表达，并分析其与临床病理特征的关系。方法：采用免疫组化法检测78例人结肠癌组织及78例相应癌旁正常组织中AEG-1和LEF-1的表达，并分析其临床病理意义。结果： AEG-1和LEF-1在结肠癌组织中的阳性表达率分别为73．1％（57／78）和67．9％（53／78），均明显高于癌旁正常组织（P ＜0．001）。 AEG-1的表达与患者的组织分化程度、淋巴结转移、远处转移及 TNM 分期有关（P ＜0．05），LEF-1的表达与患者的淋巴结转移、远处转移及 TNM 分期有关（P ＜0．05）。结肠癌组织中 AEG-1与 LEF-1的表达呈正相关（r ＝0．326，P ＝0．004）。结论： AEG-1和LEF-1的异常表达与结肠癌的发生、发展、浸润及转移密切相关，联合检测更有利于结肠癌的早期诊断及预后的判断。
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抗淋巴样增强因子-1羧基端单克隆抗体的制备及其表位的初步鉴定
目的 制备抗淋巴样增强因子-1(LEV-1)羧基端86个氨基酸(Lct86)特异性单克隆抗体,并初步明确其表位,为进一步研究LEF-1 C端特异序列的功能奠定基础.方法 从Jurkat细胞株中扩增LEF-1 C端特异序列eDNA,并克隆入PQE40、pET32a原核表达载体;分别转化入M15、BL21(DE3)感受态菌,IPIG诱导表达;纯化PQFAO-Lct86融合蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体,以pET32a-Lct86融合蛋白鉴定单克隆抗体特异性.LEF-1 C端特异序列不同长度的基因片段定向克隆人PQE40,鉴定各片段的表达,利用Western blotting初步鉴定单克隆抗体的表位.结果 成功构建了PQE40-Lct86、pET32a-Lct86重组原核表达载体;纯化获得PQE40-Lct86融合蛋白;得到一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,证实其表位位于437aa～454aa.结论 成功制备了一株特异性的抗LEF-1 C端单克隆抗体TMAb1,并鉴定其抗原识别表位位于437aa～454aa,为进一步研究LEF-1 C端的功能奠定基础.
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siRNA干扰LEF-1的表达对骨肉瘤细胞株F5M2侵袭和迁移的影响
目的:检测LEF-1在骨肉瘤细胞株F4和F5M2中的表达；探讨siRNA干扰前后对骨肉瘤细胞中LEF-1的表达及对细胞侵袭和迁移的影响.方法:采用Western-blot及qRT-PCR检测具有不同转移能力的骨肉瘤细胞株(F4,F5M2)中LEF-1的表达水平；利用RNAi干扰技术将LEF-1 siRNA转染到F5M2细胞中,使用Western-blot检测转染LEF-1 siRNA后细胞中LEF-1蛋白的表达变化；Tanswell实验检测干扰LEF-1的表达对F5M2细胞侵袭和迁移的影响.结果:LEF-1在骨肉瘤细胞株F4,F5M2中差异表达,其中在F5M2细胞中的表达较高.在转染LEF-1 siRNA的F5M2细胞中,LEF-1蛋白表达水平显著降低.Tanswell实验结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组F5M2细胞的侵袭和迁移能力显著降低.结论:LEF-1 siRNA可以下调骨肉瘤细胞中LEF-1的表达,抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移.LEF-1有可能成为骨肉瘤诊治的新靶点.
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β-catenin依赖性 LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响
目的 探讨β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF-1的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His中,脂质体法转染Hela细胞,G418筛选稳定表达目的 基因的细胞株,Western blot鉴定目的 基因的表达,MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,裸鼠体内成瘤实验检测β-catenin依赖性LEF-1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响.结果 成功构建LEF-1真核表达质粒,获得稳定表达β-catenin依赖性LEF-1亚型的HeLa细胞株,转染后的细胞增殖速度加快,凋亡水平降低,体内成瘤能力加强.结论 全长型LEF-亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用.
