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抑制聚ADP核糖聚合酶1活性的短发夹RNA载体构建
目的构建抑制人聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)活性的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向hPARP1基因的寡核苷酸,各69对碱基,退火,然后利用BamHⅡ及EcoRⅠ与pSIREN-RetroQ载体连接.用EcoRⅠ及BglⅡ切取其中U6启动子及下游的shRNA部分,与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-shRNA载体.结果重组构建的pEGFP-C1P1、pEGFP-C1P2、pEGFP-C1N载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明330个碱基成功插入到预计位点.结论载体的成功构建,为进一步研究聚ADP-核糖聚合酶在DNA修复过程中的功能打下基础.
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BMP7基因真核表达载体的构建及荷瘤小鼠制备
目的 克隆BMP7基因及构建BMP7基因真核表达载体,稳定转染于H22细胞系,制备荷瘤小鼠.方法 应用RT-PCR技术从人胚肾细胞系293T细胞总RNA中成功扩增出1 293 bp包含BMP7基冈编码区的cDNA序列,在上下游加上BamHI及HindⅢ双酶切位点后形成带酶切位点的BMP7基因,然后连入含BaraH Ⅰ及HindⅢ双酶切位点的pEGFP-C1表达质粒上,构建BMP7基因的重组真核表达质粒pEGFP-C1- BMP7.脂质体介导方法转染细胞,RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达,皮下注射制备荷瘤小鼠.结果 扩增的cDNA经测序比较与基因文库完全一致；BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,质粒形成约4.7 kb和约1.3 kb两条带,与理论计算值完全一致.注射转染BMP7基因后H22细胞小鼠瘤体明显增大.结论 成功克隆BMP7基因及构建BMP7基因的真核表达载体.BMP7基因高表达可能是细胞癌变的原因之一.
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hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析
目的：构建包含有核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1，并对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA，以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物，反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA，并以其为模板，降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因，利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1，在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒，然后将重组质粒转染入HeLa细胞内，以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况，Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况，后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA（应激颗粒的标记成分）及DPC1a（加工体的标记蛋白）的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达；EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位，但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNP A1质粒成功构建并表达，应激状态下EGFP标记的hnRNP A1参与应激颗粒的构成。
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新型纳米载体SuperfectTM适转染条件的研究
目的:对新型纳米转染载体SuperfectTM的转染效率和细胞毒性进行初步研究,以探讨其适的转染条件.方法:以50%融汇率的小鼠黑色素瘤细胞为靶细胞,在不同条件下将,报告基因质粒pEGFP-C1与载体SuperfectTM混合为复合物进行转染.各实验组:不同的质粒剂量(0.25 μg,0.50 μg)、不同的N/P(N:载体分子表面胺基的数量,P:DNA中磷酸基团的数量)比(2:1,5:1,10:1)及复合物与细胞的孵育时间(3 h,6 h).各对照组:裸质粒转染组、载体转染组,非转染组为对照.转染72 h后,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测细胞毒性. 结果:在不同条件下,SuperfectTM的转染效率有显著性差异(P＜0.05),其细胞毒性与载体剂量和孵育时间相关.当质粒剂量为0.5 μg,N/P比为5:1,复合物与细胞孵育3 h时,SuperfectTM不仅具有较高的转染效率,而且表现出较低的细胞毒性.结论:SuperfectTM是一种高效低毒的转染载体,其适转染条件主要与N/P比及复合物与细胞的孵育时间相关.SuperfectTM在基因治疗领域将具有良好的应用前景.
关键词： SuperfectTM 转染 pEGFP-C1 -
PEGFP-C1-PHF6质粒的构建和鉴定
目的:构建含有PHF6基因的PEGFP-C1-PHF6重组质粒并对重组质粒进行鉴定,为进一步研究其在核仁中的定位和功能奠定基础.方法:野生型293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应从总cDNA中扩增出PHF6基因,上下游分别引入EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ酶切位点,双酶切后将其插入PEGFP-C1质粒中,构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH5a进行克隆,提取质粒进行酶切和测序鉴定.脂质体法转染重组质粒至Hela细胞株中,Western blot检测PHF6基因蛋白的表达情况.结果:重组质粒经限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定及DNA测序鉴定结果均证实PHF6基因已正确克隆到PEGFP-C1载体中,Western blot结果进一步证实PEGFP-C1-PHF6重组质粒构建正确.结论:成功并正确构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒.
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新型转染试剂SuperfectTM转染效率的初步研究
SuperfectTM是一种新型的纳米转染载体,该实验以小鼠黑色素瘤细胞为靶细胞,以pEGFP-C1为导入基因,探讨了其转染效率和细胞毒性.结果显示,当质粒剂量为0.5ug,载体与质粒用量比为5:1,两者形成的复合物与细胞孵育3h时,SuperfectTM具有较高的转染效率,且细胞毒性较低.高效低毒的SuperfectTM在基因治疗领域将具有良好的应用前景.
关键词： SuperfectTM 转染 pEGFP-C1 -
pEGFP-C1-miR-335重组质粒的构建及其在乳腺癌细胞中的表达
目的 构建携带融合型microRNA(微小RNA)基因miR-335的荧光真核表达质粒pEGFP-C1-miR-335,并观察其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达.为研究小RNA基因表达调控机制建立实验基础. 方法 应用基因重组技术,从人类基因组DNA中扩增miR-335的前体序列,经PCR引物加入酶切位点, 酶切后插入荧光真核表达载体pEGFP-C1, 构建miR9真核表达载体pEGFP-C1-miR-335, 然后进行酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入MDA-MB-231细胞,24 h后观察荧光蛋白表达情况,用Northern blot方法检测miR-335表达. 结果 酶切和测序鉴定证实插入miR-335前体片段序列正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达,60%左右转染细胞发出荧光.Northern blot检测到miR-335表达. 结论 成功构建pEGFP-C1-miR-335荧光真核表达载体,并可在乳腺癌细胞中有效表达.
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代表PDCD5蛋白不同功能区域的质粒构建及其在胃癌细胞中的表达定位
目的 分析PDCD5蛋白的不同功能区域,将这些区域所对应的序列与质粒pEGFP-C1相连接,在胃癌细胞中表达后,检测其细胞定位.方法 设计带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的PDCD5引物共4对,包括完整的PDCD5蛋白序列及3个不同功能区域的序列.以上质粒构建完成后,转染胃癌细胞SGC-7901.荧光显微镜检测融合蛋白的表达定位.、结果 经酶切鉴定,可见相应长度的4种序列,后经测序确定序列无误,荧光显微镜检测融合蛋白表达.结论 代表PDCD5蛋白不同功能区域的质粒成功构建,并在SGC-7901细胞中表达.经过观察绿色荧光蛋白,确定4种蛋白均定位于细胞浆内.
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壳聚糖-碳纳米粒的制备及其体外性质的研究
目的制备壳聚糖-碳纳米颗粒并研究其理化性质和体外活性.方法首先,用溶胶法制备出分散性良好的碳纳米粉末,再通过正负电荷相互吸引制备出壳聚糖-碳纳米颗粒;其次,用绿色荧光蛋白(PEGFP-C1)质粒DNA作报告基因,以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA与壳聚糖-碳纳米颗粒结合形成载基因纳米粒;再次,用扫描电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布及表面电位(Zeta电位),MTT试验检测壳聚糖-碳纳米载体对HepG2细胞和COS7细胞的毒性作用,凝胶阻滞实验确定该基因载体的DNA携带率,DNase Ⅰ保护实验研究其对所携带基因的保护作用,体外纳米粒导入实验定性评价纳米粒进入在体外进入细胞的活性,并用荧光显微镜观察导入效果.结果壳聚糖-碳纳米粒表面携带正电荷,聚合指数＜0.3;与DNA结合后效率较高,且可保护DNA免受DNase Ⅰ的降解;经FITC标记后能够成功地进入到COS7细胞和HepG2细胞.结论壳聚糖-碳纳米颗粒能进入到细胞内部,且导入效率较高,可以用作基因递送的非病毒载体系统,值得进一步研究.
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MafA真核表达载体的构建及在人肝癌细胞中的表达
目的:构建肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)真核表达载体pEGFP-N2/MafA,pEGFP-C1/MafA,观察MafA在人肝癌细胞HepG-2细胞内的表达.为研究Mafa基因功能和作用机制奠定基础.方法:提取胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,在两端分别引入Hind Ⅲ和Sal Ⅰ的酶切位点.重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中,用脂质体方法转染至人肝癌细胞HepG-2细胞中,通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulin Ⅱ基因的表达.结果:通过RT-PCR获取了MafA基因并成功克隆人载体,转染的细胞有绿色荧光蛋白表达及MafA基因表达,但没检测到insulin Ⅱ基因表达.结论:成功构建质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,并成功表达MafA 基因,但没有insulin Ⅱ基因的表达.
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PRP基因绿色荧光蛋白载体构建及其生物学功能初步研究
目的:构建Prolifein related protein(PRP)基因荧光表达载体,并初步探讨其生物学功能.方法:提取小鼠睾丸RNA,RT-PCR扩增PRP基因编码区片段,酶切连入pEGFP-C1载体,构建含有PRP基因片段的绿色荧光表达载体PRP-pEGFP-C1.为了探讨PRP基因功能,PRP-pEGFP-C1经Lipofectamine2000介导转染293FT细胞,MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪分析细胞周期分布.结果:质粒PRP-pEGFP-C1经测序验证,证实PRP基因已正确连入pEGFP-C1载体.免疫荧光染色显示PRP 定位于293FT细胞胞浆.MTT结果表明,上调PRP基因引起293FT细胞增殖活性下降,细胞周期分布情况提示G1期细胞增加,S期细胞减少.结论:成功构建PRP-pEGFP-C1荧光表达载体,对其功能研究表明PRP具有抗人293FT细胞增殖,扰乱细胞增殖周期的功能.本研究为PRP在抗人肿瘤方面的研究提供基础.
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T-bet和c-FLIP双基因共表达质粒的构建及生物学活性检测
目的 构建携带T-bet和c-FLIP双基因的真核表达载体及检测其生物学活性.方法 采用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出T-bet和c-FLIP cDNA,利用pIRES和pEGFP-C1,构建T-bet和c-FLIP双基因真核表达载体pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP.采用非脂质体的脂质型介导载体将pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP转染至外周血淋巴细胞,观察T-bet和c-FLIP在外周血淋巴细胞中的表达,并检测其诱导淋巴细胞的抗凋亡作用及Th1/Th2细胞偏移.结果 成功构建pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP质粒,运用非脂质体的脂质型介导载体将该质粒转染淋巴细胞,其转染率为34.6%.流式细胞仪分析未经pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP预处理的淋巴细胞在CH-11作用24 h后,细胞的凋亡率分别为(50.12±8.02)%;经pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP预处理1 d的淋巴细胞,其细胞凋亡率分别下降到(5.73±0.37)%;双基因表达的淋巴细胞的Th1型细胞因子IFN-γ表达水平明显高于空载体表达的淋巴细胞及未经处理的淋巴细胞组(P<0.01),且Th2型细胞因子IL-4表达水平较空载体表达的淋巴细胞及未经处理的淋巴细胞低(P<0.01),差异有统计学意义.结论 转染T-bet和c-FLIP共表达基因后的T淋巴细胞可产生抗凋亡作用及向Th1细胞分化.
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人Elf5基因真核表达质粒的构建及其亚细胞定位
目的：构建人Elf5真核细胞表达质粒，并研究其在乳腺癌MCF7细胞中的亚细胞定位。方法：PCR扩增人Elf5基因，将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中，构建含人Elf5基因的真核表达质粒pEGFP-hElf5。利用酶切鉴定，DNA测序，免疫印迹及免疫荧光方法鉴定Elf5真核表达质粒及Elf5蛋白的亚细胞定位。结果：经酶切鉴定、DNA测序、免疫印迹方法确认Elf5基因成功导入真核表达载体pEGFP-C1。瞬时转染MCF7细胞，Elf5蛋白表达在细胞核中。结论：pEGFP-Elf5真核表达质粒构建成功，Elf5定位在细胞核中。
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携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的构建方法研究
目的 提高构建携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的成功率.方法 通过理论研究结合实验操作经验.结果 利用该方法可以高效率的成功构建真核表达载体.结论 文章提出的方法简便、通用、高效,可以解决重组DNA载体构建技术中的一系列关键问题,为相关研究提供了必要的理论和技术支持.
