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应激颗粒的形成和功能特点及其与疾病的相关性研究进展
当真核细胞受到环境的刺激时,胞质中形成的致密颗粒物质,即为应激颗粒(SGs).它具有抗氧化及抑制细胞凋亡的作用.mRNA结合蛋白的交互作用能促进应激颗粒的形成.转录后修饰和依赖ATP形成的RNP或蛋白重塑复合物起到调控应激颗粒的合成和分解的作用.应激颗粒具有流动性,而这种动态需要能量输入来维持.应激颗粒的形成能调节应激反应、病毒感染及信号传导过程.持续的和异常的应激颗粒的形成导致了神经退行性疾病和某些癌症的发生.
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应激颗粒与疾病相关性研究进展
应激颗粒的形成是细胞的一种保护机制，当真核细胞受到环境的刺激时，细胞胞质中形成的致密颗粒，即为应激颗粒，其具有抗氧化及抑制细胞凋亡的作用。 P小体是另一种细胞胞质中包含的未翻译mRNA、翻译阻遏物和一些mRNA降解结构的核糖核蛋白颗粒，其与应激颗粒之间可能存在信使核糖体蛋白颗粒的交换。此外，应激颗粒与神经退行性疾病、病毒感染疾病及肿瘤相关，明确应激颗粒机制有助于找到治疗应激颗粒相关疾病的新靶点。
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葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1在应激刺激下与T细胞胞内抗原1共同参与应激颗粒聚集
目的 探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)在应激刺激下如何与T细胞胞内抗原1(TIA-1)共同参与应激颗粒(SG)的聚集以及如何调节应激反应.方法 利用免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞中的SND1蛋白与TIA-1蛋白在应激刺激下是否形成共定位颗粒,并利用绿色荧光蛋白载体过表达质粒转染HeLa细胞进行外源蛋白表达,从而确定在应激刺激下SND1蛋白与TIA-1结合的结构域.利用RNA干扰技术敲除HeLa细胞中SND1蛋白表达并利用Western Blotting检测蛋白表达水平,从而观察SND1低表达是否对TIA-1聚集形成SG产生影响.利用不同热休克刺激时间观察SND1与TIA-1的聚集过程是否存在动态变化.结果 SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白结合共同参与SG聚集,其主要作用结构域为葡萄球菌核酸酶结构域(SN domain).SND1低表达不会抑制TIA-1聚集到SG,但会减少SG的数量.在不同热休克刺激时间下,SND1聚集到SG的运输过程滞后于TIA-1.结论 SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白共同参与SG的聚集,从而调节细胞应激反应.
关键词： 应激 RNA干扰 葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1 T细胞胞内抗原1 应激颗粒 -
hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析
目的：构建包含有核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1，并对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA，以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物，反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA，并以其为模板，降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因，利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1，在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒，然后将重组质粒转染入HeLa细胞内，以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况，Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况，后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA（应激颗粒的标记成分）及DPC1a（加工体的标记蛋白）的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达；EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位，但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNP A1质粒成功构建并表达，应激状态下EGFP标记的hnRNP A1参与应激颗粒的构成。
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针对人SND1基因两个AUG的细胞应激分析
目的：针对人SND1基因2个蛋白翻译起始密码子AUG构建真核表达质粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2，并分析2个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。方法以SND1全长转录本为模板，PCR法扩增含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的目的基因SND1-No1/2，双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pCMV-N-Flag，以T4-DNA连接酶将两者连接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒，然后将构建的重组质粒转染入HeLa细胞内，以Western印迹法检测Flag标签（DYKDDDDK）与SND1-No1/2的融合表达，后以细胞免疫荧光实验检测在氧化应激状态下Flag-SND1-No1/2融合蛋白与内源性SND1应激颗粒的胞内共定位情况。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，Western印迹结果检测到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表达；细胞免疫荧光结果显示Flag-SND1-No1/2均可与内源性SND1应激颗粒共定位。结论重组pCMV-N-Flag-SND1-No1/2质粒构建成功，SND1基因第1个AUG的缺失并不影响SND1应激颗粒的形成。
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pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建及鉴定
目的 构建并鉴定pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒,为深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病的生物学作用奠定基础.方法 提取HeLa细胞总RNA,反转录出含Argonaute1的cDNA;以Argonaute1 cDNA为模板,采用PCR法扩增出带有EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到pmCherry-C1载体上;将构建成功的pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒转染入HeLa细胞内,以Western blotting法检测Argonaute1与樱桃红(Cherry)蛋白的融合表达情况;以激光共聚焦显微镜观察细胞内Argonaute1蛋白与细胞应激颗粒的标记蛋白(G3BP)及加工体的标记蛋白(DCP1α)的应激共定位关系.结果 以EcoRⅠ、BamHⅠ单、双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误;融合蛋白表达阳性;当细胞受到应激时,Argonaute1蛋白与G3BP、DCP1α蛋白共定位.结论 本研究成功构建重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒.该质粒可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白,有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病领域的生物学作用.
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活细胞内人IGFBP2-3'UTR基因的GFP-MS2荧光系统标记
目的 利用GFP-MS2系统在活细胞内对胰岛素样生长因子结合蛋白2 (insulin-like growth factor-binding protein 2,IGFBP2)mRNA 3′非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)进行绿色荧光标记,构建pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2重组质粒.方法 提取HeLa细胞总RNA,以针对IGFBP2-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带有EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的IGFBP2-3′UTR目的 基因,再利用双酶切法将目的 片段连接到pSG5载体(启动子为T7)上,构建重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR;同时,以BglⅡ和BamHⅠ双酶切法从pCR4-24×MS2SL-stable质粒上切下24×MS2结合位点片段并将其插入pT7-IGFBP2-3′UTR,构建重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2;然后将构建的重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2、pMS2-GFP质粒与pERFP-Tudor-SN质粒共同转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜检测IGFBP2-3′UTR的荧光标记情况及应激共定位.结果 以酶切质粒法及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,激光共聚焦结果显示在胞浆中检测到IGFBP2-3′UTR的绿色荧光信号,在细胞受到氧化应激时IGFBP2-3′UTR信号呈颗粒状聚集,且与应激颗粒(stress granules,SGs)的标志蛋白Tudor-SN呈共定位关系.结论 针对IGFBP2-3′UTR的GFP-MS2荧光标记系统质粒构建成功;细胞应激时,IGFBP2-3′UTR被招募至SGs结构中.
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dsRNA诱导应激颗粒形成的研究
目的 探索病毒感染产生的中间产物双链RNA(dsRNA)分子刺激对细胞形成应激颗粒(SG)的影响,为进一步研究病毒诱导与拮抗SG形成的分子机制提供实验依据.方法 采用不同长度的dsRNA,包括长链(HMW,1.5～8 kb)、短链(LMW,0.2～1 kb)以及小分子dsRNA(19 bp),分别转染A549细胞,模拟病毒感染产生的应激压力.通过免疫荧光检测形成SG的细胞百分率,以及蛋白免疫印迹(WB)检测不同长度的dsRNA诱导抗病毒激酶蛋白激酶R (PKR)及其底物eIF2α的活化水平.结果 HMW、LMW dsRNA可诱导A549细胞产生SG,而小分子dsRNA并不能诱导SG产生.免疫印迹结果发现HMW、LMW dsRNA可诱导PKR和下游底物eIF2α的磷酸化,而小dsRNA不足以活化PKR.结论 病毒可能通过降解其dsRNA避免PKR的激活和SG形成,从而逃逸宿主应激应答.
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病毒感染与真核细胞应激颗粒
病毒感染真核细胞后诱导细胞eIF-2α磷酸化,翻译的起始受到阻滞,mRNA随后与起始因子、核糖体亚基、mRNA结合蛋白(TLA-1、G3BP、HuR等)结合,聚集形成细胞质RNA应激颗粒(SG).近几年的研究表明SG可影响病毒复制过程,而病毒亦可通过与SG蛋白组分的相互作用,反馈调节SG形成.本文介绍了SG的形成、组分、生物学意义,以及病毒与SC之间的相互关系.
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病毒感染与细胞应激颗粒
应激颗粒(stress granules,SGs)是真核细胞受环境刺激如氧化应激、热休克、紫外线照射、病毒感染时,在胞质中形成的致密颗粒状聚合体[1-4].SG的成分包括未翻译的mRNA、40S核糖体亚单位、翻译起始因子(如eIF4E、eIF3、eIF2、eIF4A、eIF4G和eIF4B)、RNA结合蛋白如Poly (A)结合蛋白[poly (A)-binding protein,PABP]、T细胞胞质内抗原(T-cell intracellular antigen 1,TIA-1)、TIA1相关蛋白(TIA1-related protein,TIAR)、人抗原R(human antigen R,HuR)、脆性X智力迟滞蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)、锌指蛋白tristetraprolin (TTP)和Ras GTPase激活蛋白结合蛋白1(Ras GTPase-activating protein-binding protein 1,G3BP1)[1-4].
