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人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定
目的:构建人葡萄糖调节蛋白94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型.方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中,获得重组载体.瞬时转染293T细胞,采用Western blot法检测GRP94蛋白表达量.pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒.以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株.用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证.结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确.HeLa细胞经慢病毒感染、药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P＜0.01).成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白.结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVx-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础.
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卵巢癌细胞系OVCAR3过表达SND1稳定株的构建
目的:通过慢病毒载体构建过表达SND1的OVCAR3稳定的表达株.方法:重组的pLVX-FLAG-SND1表达载体与包装质粒共同转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒.病毒感染的OVCAR3细胞经Hygromycin B筛选出稳定表达株.用Western blot方法检测SND1蛋白表达.结果:用病毒感染OVCAR3细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中SND1蛋白表达水平明显增高.结论:利用慢病毒表达载体pLVX-FLAG-SND1成功感染并筛选出稳定表达SND1的OVCAR3细胞株,为进一步研究SND1在卵巢癌中的作用提供了体外细胞系模型.
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利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株
目的：利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因，构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法：设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA，以PX462质粒为载体，构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后，将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，挑取单克隆细胞进行培养。后用Western Blot鉴定敲除效果。结果：sgRNA正确插入到PX462质粒载体中，转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论：成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。
关键词： SND1 基因敲除 CRISPR/Cas9 Hela细胞 -
针对人SND1基因两个AUG的细胞应激分析
目的：针对人SND1基因2个蛋白翻译起始密码子AUG构建真核表达质粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2，并分析2个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。方法以SND1全长转录本为模板，PCR法扩增含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的目的基因SND1-No1/2，双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pCMV-N-Flag，以T4-DNA连接酶将两者连接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒，然后将构建的重组质粒转染入HeLa细胞内，以Western印迹法检测Flag标签（DYKDDDDK）与SND1-No1/2的融合表达，后以细胞免疫荧光实验检测在氧化应激状态下Flag-SND1-No1/2融合蛋白与内源性SND1应激颗粒的胞内共定位情况。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，Western印迹结果检测到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表达；细胞免疫荧光结果显示Flag-SND1-No1/2均可与内源性SND1应激颗粒共定位。结论重组pCMV-N-Flag-SND1-No1/2质粒构建成功，SND1基因第1个AUG的缺失并不影响SND1应激颗粒的形成。
