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Dicer蛋白在RNA干涉中的作用研究进展
近年来,对功能基因组的研究使人们对基因功能的认识不断深入.后基因时代的来临,又使基因功能研究备受瞩目.RNA干涉对基因表达的抑制为我们提供了新的研究工具.RNA干涉(RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程.它是转录后基因沉寂(PTGS)的一种.本文简要介绍RNAi的发生机制及该过程中重要分子Dicer的研究进展.
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斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因的时序性表达
目的 探讨斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因时序性表达规律.方法 取正常发育至受精后4、8、12、16、20、24、36、48和72 h(hpf)斑马鱼胚胎各约40枚,用Trizol法分别提取总RNA,茎环法反转录为cDNA,用Real-time PCR检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量.结果 miR-9、miR-219及Dicer表达水平在胚胎发育过程中呈现峰谷变化,不同发育阶段之间总的差异有统计学意义(P＜ 0.05).与胚胎发育全程的基因平均表达水平相比,miR-9在8 hpf之前表达量较低(P＜0.05),36 hpf后表达量持续增高,48 hpf和72 hpf时表达量显著高于平均水平(P＜0.01).miR-219在8 hpf之前表达量也处于较低水平(P＜0.05),20 hpf后迅速增高,24hpf时达到峰值,并持续到48 hpf(P ＜0.01).Dicer在胚胎早期(4 hpf)就有明显表达(P＜0.05),随后表达水平迅速下降,16 hpf时达到低点(P＜0.05),然后逐渐回升,直至胚胎末期.结论 斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达有一定规律,miR-9主要在胚胎后期表达,miR-219主要在胚胎中期表达,Dicer主要在胚胎早期表达,其次在胚胎后期,提示miR-9、miR-219及Dicer参与胚胎发育调控过程.
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PIWIL1蛋白与DICER酶在肝细胞癌中的表达及意义
目的 探讨PIWIL1蛋白与DICER酶在肝细胞癌组织中的表达及临床意义.方法 免疫组化检测47例肝细胞癌标本中PIWIL1与DICER的表达.蛋白印迹法检测31例肝细胞癌组织中PIWIL1与DICER的表达.分析PIWIL1与DICER表达及与临床特征的关系.结果 PIWIL1在癌组织中高表达,在正常肝组织中低表达(P＜0.05).DICER在正常肝组织中高表达,在癌组织中低表达或缺失(P＜0.05).PIWIL1和DICER与肿瘤分化程度、临近组织侵犯相关(P＜0.05),PIWIL1与DICER在组织中的表达呈负相关(P＜0.05).结论 PIWIL1的高表达和DICER的低表达或缺失与病理分化程度及临近组织侵犯相关,PIWIL1与DICER的表达负相关.
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核酸内切酶在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达和临床意义
目的 研究核酸内切酶(Dicer)在肝门部胆管癌组织和胆管癌细胞株(QBC939)中的表达及其与临床病理因素和预后的相关性.方法 采用免疫组化染色检测40例肝门部胆管癌和10例正常胆管组织中Dicer的表达；Western-blot和RT-PCR检测人胆管癌细胞株QBC939与人胆管上皮细胞株HIBEpic中Dicer的表达量；分析Dicer表达与临床病理因素的相关性.对根治性切除的肝门部胆管癌患者术后总生存期和无病生存期进行单因素和多因素分析.结果 Dicer在肝门部胆管癌组织中的表达明显低于正常胆管组织(P＜0.05),在QBC939中的表达明显低于HIBEpic(P＜0.05),高分化胆管腺癌中Dicer表达明显高于中、低分化腺癌.单因素生存分析结果显示Dicer低表达组的根治性切除术后总生存期和无病生存期均短于高表达组(P＜0.01).多因素分析显示Dicer表达水平为与预后相关的独立危险因素(P＜0.05).结论 在肝门部胆管癌和胆管癌细胞株Dicer表达下调；低表达Dicer的胆管癌患者预后更差.Dicer可能为肝门部胆管癌的诊断和判断预后的分子标志物.
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DICER基因多态性与食管癌遗传易感性研究
目的:研究中国汉族人DICER基因rs3742330 A＞G多态性与食管癌易感性的关系.方法:本研究以病例-对照研究为基础,收集2008-10-01-2009-11-30镇江第一人民医院和江苏大学附属人民医院380例食管癌患者和380例非肿瘤患者,采用质谱(MALDI-TOF MS)技术对DICER基因多态性位点rs3742330 A＞G进行分型,计算不同基因型与食管癌的发生风险及95％CI.结果:DICER多态性位点rs3742330 A＞G基因型AA、AG和GG在食管癌组频率分别为33.9％、51.6％和14.5％,在非肿瘤对照组的频率分别为38.1％、48.4％和13.5％.Logistic回归分析结果表明,相对于AA基因型的个体,AG基因型与食管癌的发病风险无明显相关,OR=1.19,95％CI=0.87～1.62;与AA+ AG基因型相比较,GG基因型与食管癌的发病风险无明显相关,OR=1.09,95％CI=0.72～1.65.结论:DICER基因rs3742330A＞G多态性可能不是食管癌发生的危险因素.
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稳定转染Dicer基因对HELF细胞功能的影响
目的 观察正常人胚肺成纤维细胞(HELF)在稳定转染Dicer基因后增殖能力及迁移能力的变化.方法 应用脂质体介导方法 转染Dicer基因表达载体于HELF细胞,G418筛选,PCR检测整合情况,RT-PCR检测表达情况,Western-blot检测蛋白表达水平,确定稳定转染细胞株,MTT方法 检测细胞增值能力,Transwell方法 检测细胞迁移能力.结果 Dicer基因稳定转染HELF细胞系建立,用RT-PCR和Western-blot方法 检测到Dicer基因mRNA和蛋白表达水平都明显增强.与转染空载体的HELF细胞相比,转染Dicer基因的HELF细胞48、72、96 h的MTT光吸收值明显升高(P＜0.05),并且穿过人工重构基底膜的细胞数明显增多.结论 Dicer基因稳定转染HELF细胞后,HELF细胞增殖能力和迁移能力都明显增强.
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RNA干扰的实现方法及临床应用前景
RNAi(RNA interference)现象的发现及其在生物学上的应用无疑具有划时代的意义.其快速、简洁、特异性强的优点,使其一出现就受到科研工作者的青睐,很多研究机构正积极准备在近几年内将其应用于临床.RNAi技术方法简单,对实验室条件要求不高,而且国外也是刚刚开始探索.因此,如果我们迅速了解并掌握这门技术并应用于临床,将有助于我们在此领域赶超国外同行.下面就目前主要的RNAi技术和研究中所需要注意的问题做一综述.
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MiRNA的研究进展
MiRNA(MicroRNA)是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性21-25 nt短序列非编码单链RNA,在进化上具有高度的保守性,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,在基因调控中扮演重要的角色.本文式从MiRNA的概念特点作用机制及功能等方面对MiRNA的研究进展作一个简单回顾.
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大肠癌中Dicer与miRNA-155表达及临床意义
目的 探讨Dicer与miR-155的表达在大肠癌发生发展中的临床意义.方法 采用免疫组化法及实时荧光定量PCR法,分别检测大肠癌中Dicer与miR-155的表达,并分析二者的相关性,以及二者与大肠癌患者临床参数的相关性.结果 与癌旁组织比较,大肠癌组织中,Dicer蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);与健康体检者比较,大肠癌患者miR-155表达水平显著增高(P＜0.01).与Dicer高表达患者比较,Dicer低表达患者外周血中miR-155表达水平显著增高(P＜0.01).与浸润深度及浆膜内者比较,浸润及浆膜外者Dicer表达水平显著降低(P＜0.05),miR-155表达水平显著升高(P＜0.01).与Dukes分期A、B期比较,Dukes分期C、D期患者Dicer表达水平显著降低(P＜0.05),miR-155表达水平显著升高(P＜0.05).结论 大肠癌中存在Dicer表达降低以及miR-155表达增高,二者显著相关,且与大肠癌浸润和病程进展相关.
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microRNA与肿瘤的关系
miRNA是一类分布广泛的非编码小分子RNA,其长度约为22个核苷酸,它的功能是通过负调控基因的表达从而调节细胞的生理过程,但当其表边异常时可能引起疾病甚至肿瘤的形成.过去肿瘤的研究大多数都集中于对原癌基因和抑癌基因突变的研究上.目前,发现许多肿瘤的发生很可能是受miRNA的影响,miRNA也可以起到抑癌基因或原癌基因的作用.miRNA表达的异常可能与其染色体脆性位点存在几率较高有关.本文对miRNA的结构、功能及其与肿瘤发生关系等方面进行了综述.
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Dicer1敲除对肝脏胆酸代谢和转运功能的影响
目的:微小RNA(microRNAs,miRNAs)在胆固醇的合成,代谢和转运中起着重要作用,而miRNAs在胆固醇代谢物胆酸的代谢和转运中的作用尚不清楚.Dicer基因是miRNAs生成过程的关键酶.本课题使用肝脏特异的Dicer1基因敲除小鼠,考察肝脏Dicer1基因敲除对C57BL/6小鼠肝脏胆酸代谢和转运的影响.方法:使用白蛋白启动子驱动的Cre重组酶和Loxp系统(A1b-Cre/Loxp)在小鼠肝脏中特异的敲除Diced基因;分别收集3～12周龄的小鼠血液和肝脏组织,使用Cobas生化仪检测小鼠血液和肝脏中总胆酸含量;利用实时定量PCR的方法分析肝脏中胆汁酸代谢转运相关基因的表达.结果:实验发现,肝脏Dicer 基因敲除后,胆酸在血液和肝脏中明显蓄积,弥漫性肝细胞轻微空泡化,偶见单个肝细胞坏死.检测胆酸代谢和转运相关基因的表达发现,胆酸合成相关基因的表达有轻度升高,但缺乏统计学差异;在肝脏细胞血管侧的胆酸摄取转运体中,Oatp1a1在Dicer1 敲除小鼠肝脏中明显下调,Ntcp和Oatp1b2则无明显改变;而肝细胞血管侧胆酸外排转运体的表达均有显著升高,胆管侧的外排转运体中Abcb11表达有明显增加.结论:Dicer基因敲除后,胆酸在血液和肝脏中明显蓄积,肝脏和血液中胆酸总量显著增加.血液中胆酸的蓄积可能与肝脏细胞血管侧摄取转运体的低表达和血管侧外排转运体的高表达有关;而肝脏中胆酸的蓄积可能部分来自于轻度升高的胆酸合成酶,胆酸在肝细胞内运输途径的紊乱可能与肝脏和血液中胆酸总量的显著增加相关.
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miRNAs的研究进展
MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA,广泛存在于真核生物中.miRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性.miRNAs可以通过部分互补或者完全互补结合到目的靶mRNA,以诱发蛋白质翻译抑制(翻译抑制子)或者介导目的mRNA的降解调节基因表达,参与生命过程中一系列的重要进程,包括细胞分化、生物发育、疾病的发生、发展,此外miRNAs还与病毒的复制和癌症等有关.miRNA作用和功能的揭示必定给miRNA的应用带来广阔前景.
关键词： microRNAs(miRNAs) siRNA Dicer 发育 -
系统性红斑狼疮外周血Dicer和Ago2的表达
Dicer和Ago2是RNA干扰(RNAi)中重要的酶,本研究检测常见自身免疫病系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)患者中Dicer和Ago2的表达水平并分析其与SLE临床特征的相关性.方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测41例SLE、24例RA、13例AS患者和21例正常人外周血白细胞中Dicer和Ago2的表达水平,并分析其与SLE疾病活动指数(SLEDAD、SLE肾脏损伤活动指数(renal-SLEDAI)及临床用药之间的相关性.结果显示,Dicer表达水平在SLE、RA和AS患者中较正常对照显著升高(P=0.0051; P＜0.0001; P=0.0001),而Ago2表达水平仅在SLE患者中显著升高(P=0.0015).Dicer表达水平在中度以上活动性SLE患者中较轻度以下活动性患者显著升高(P=0.032),并且与SLEDAI正相关(r=0.4075,P=0.0254),在狼疮肾炎患者中较无狼疮肾炎患者显著升高(P=0.0367),与renal-SIEDAI显著正相关(r=0.4014,P=0.0309),但Ago2表达水平与SIEDAI积分无明显相关性,且在狼疮肾炎患者中也无明显变化,不同量激素治疗组之间Dicer与Ago2均无显著差异.提示,Dicer和Ago2的表达水平在SLE患者中均显著升高且前者与SLEDAI积分、Renal-SLEDAI积分正相关,Dicer升高提示SLE活动及肾脏损害,可能参与SLE的发病.
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MicroRNA生物合成相关基因在肝癌中的表达及其意义
目的 通过检测肝癌和癌旁组织中microRNA(miRNA)合成相关基因的mRNA表达,分析其与肝癌恶性行为的关系.方法 运用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肝癌组织及其配对癌旁组织中miRNA生物合成相关基因的mRNA表达水平,比较分析其表达水平差异及其与肝癌预后的关系.结果 RT-PCR结果显示,与相应的癌旁组织相比,肝癌组织中细胞核内miRNA生物合成相关基因Drosha、DGCR8、DBR1、ADAR、Exportin 5的mRNA表达水平显著升高(P＜0.0001),而细胞质内miRNA生物合成相关基因Dicer、AGO2、GEMIN3、GEMIN4的mRNA表达水平显著下降(P＜0.0001).肝癌组织中DBR1和Exportin 5 mRNA高表达患者的总生存率高于低表达患者(P＜0.05),癌旁组织中DGCR8mRNA高表达患者的总生存率高于低表达患者(P＜0.05).结论 Dicer的表达可能在肝癌发生发展过程中起重要作用.DBR1、Exportin 5和DGCR8可以作为肝癌治疗的潜在干预靶点.
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实时荧光定量RT-PCR检测原发性肝细胞癌中Dicer mRNA的表达
目的:建立Dicer mRNA 表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)系统,检测肝癌细胞系与20例原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)组织中Dicer mRNA的表达水平.方法:根据Dicer mRNA的全序列设计特异性引物,结合荧光染料SYBR Green Ⅰ,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度, 进行熔解曲线分析排除非特异性扩增,根据标准品绘制标准曲线,由软件自动计算出待测样品Dicer mRNA的准确含量,并以Dicer mRNA和18S rRNA含量的比值作为Dicer表达水平的指标.结果:该方法检测的线性范围为5×102～5×109 copies/μl,样本的批内变异系数与批间变异系数为4.13%～19.72%和6.25%～18.76%.Dicer mRNA在HBV阳性肝癌细胞系HepG2.2.15和HBV阴性肝癌细胞系HepG2的表达水平明显低于正常肝细胞系WRL-68(P＜0.05);在PHC组织的表达水平明显低于癌旁配对组织(P＜0.05).结论:该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性.Dicer mRNA 表达量在肝癌细胞系和PHC组织中的检测为以后更好的研究PHC的发病机制奠定了理论基础.
关键词： Dicer 癌 肝细胞 实时荧光定量RT-PCR -
TWEAK调控Dicer促使巨噬细胞源性外泌体分选miR-7至卵巢癌细胞的机制
目的·研究TWEAK通过何种途径促使巨噬细胞源性外泌体分选miR-7至卵巢癌细胞.方法·收集TWEAK刺激前后的巨噬细胞,real-time PCR和Western blotting检测巨噬细胞中Dicer的表达.在巨噬细胞中沉默Dicer,real-time PCR检测巨噬细胞及其外泌体中miR-7的表达;过表达Dicer,real-time PCR检测巨噬细胞中miR-7的表达.继而用TWEAK刺激巨噬细胞,real-time PCR检测巨噬细胞源性外泌体中miR-7的表达,Western blotting检测TWEAK刺激前后的巨噬细胞中核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路的表达;继而将NF-KB信号通路抑制,Western blotting检测TWEAK刺激前后巨噬细胞中Dicer的表达.结果·TWEAK刺激后,巨噬细胞中Dicer的表达下调.沉默巨噬细胞中Dicer的表达,巨噬细胞及其外泌体中miR-7的表达均上调;而将巨噬细胞中的Dicer过表达,再用TWEAK刺激巨噬细胞后,与对照组相比,Dicer过表达组巨噬细胞及其外泌体中的miR-7表达降低.TWEAK刺激巨噬细胞后,NF-κB信号通路蛋白的表达上调;而抑制NF-κB信号通路,再用TWEAK刺激巨噬细胞后,Dicer的表达无明显改变.结论·TWEAK通过活化NF-KB通路,抑制Dicer表达,从而促进巨噬细胞分选miR-7至其外泌体.
关键词： 上皮性卵巢癌 肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂 Dicer 巨噬细胞 外泌体 -
microRNAs在神经系统生长发育和疾病中的作用
背景 microRNAs(miRNAs)是一群长约21～23个核苷酸的小片段非编码内源性RNAs,通过在转录后水平调节多个靶标,参与多种信号通路的调节,在诊断疾病、评估预后、防治疾病等方面具有广泛的应用前景. 目的 阐述miRNAs在神经系统中的作用. 内容 miRNAs在神经系统的生长发育分化过程、神经系统退行性疾病、神经系统肿瘤以及脑损伤的发生发展过程中的重要作用. 趋向 miRNAs可用于神经系统疾病的诊断、防治.
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宫颈组织HPV感染与Dicer基因表达相关性分析
在世界范围内官颈癌发病率位于女性肿瘤的第二位,每年有近50万女性被确诊为宫颈癌[1].大量临床证据与研究结果都证实人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的感染是宫颈癌发生的必要条件和主要危险因素,然而HPV感染在育龄期妇女中相当常见[1].由于微小核糖核酸(microRNA,miRNA)已被报道是潜在的癌基因或抑癌基因,作为其加工酶,Dicer也备受关注.Dicer基因在果蝇中首次发现,初被认为是为了抵抗病毒入侵进化而来[2].
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Dicer在肿瘤中的研究进展
Dicer是miRNA剪切成熟的关键酶,在肿瘤中扮演单倍体不足抑癌基因的角色.Dicer基因突变携带者易发生家族性肺胸膜母细胞瘤；Dicer在各种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,基因低表达肿瘤更常表现出恶性程度高和预后差的特点；同时也能介导对药物治疗的敏感性；另外Dicer与miRNA之间复杂的调控体系是其参与肿瘤发生发展的根本所在,可为肿瘤的靶向治疗提供研究基础.
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RNA干扰技术的研究进展
RNA干扰是一项新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象.尽管RNA干扰发现的时间较短,但由于其具有操作简单、成本低、特异性高和高效性等特点,因而发展迅速,目前对于它的机制已有初步的了解,同时RNA干扰在功能基因组学以及疾病的基因干预治疗方面也有一定的进展.该文就RNA干扰技术的历史、作用机制、生物学意义及应用作简要概述.
