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Myosin Va RNAi慢病毒载体的构建及对肺癌PG细胞运动和迁移能力的影响
目的 构建人非常规肌球蛋白myosin Va基因RNAi慢病毒载体,并探讨其对人肺巨细胞癌PG细胞运动和迁移能力的影响. 方法 针对已经筛选确定的myosin Va基因RNAi有效靶序列,合成靶序列及其阴性对照的寡聚DNA,并连接到pSuper载体获得中间实验质粒pSuper-shM5A及阴性对照pSuper-shCON;然后将H1 promoter-shM5A/shCON表达框重组到慢病毒载体plenti4上,分别得到plenti4-H1-shM5A和shCON 载体,并进行慢病毒包装.随后用病毒上清感染PG细胞,并筛选出zeocin抗性的稳定细胞系PG-shM5A和shCON.通过RT-PCR方法检测PG-shM5A和shCON细胞的myosin Va mRNA表达水平;用创伤愈合和Boyden小室实验测定PG-shM5A和shCON细胞的运动和迁移能力. 结果 限制性内切酶酶切和测序证实,成功构建myosin Va RNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A.慢病毒包装成功后,感染PG细胞并获得zeocin抗性的细胞;用RT-PCR方法证明,myosin Va mRNA被抑制70%以上.创伤愈合和Boyden小室实验表明,感染携带myosin Va RNAi慢病毒的PG细胞运动和迁移能力显著下调. 结论 成功构建myosin Va RNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A,它能有效抑制人肺巨细胞癌PG细胞的myosin Va表达并降低其运动和迁移能力,初步揭示了myosin Va与肿瘤细胞恶性行为的相关性.
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肌球蛋白调节性轻链在慢性心力衰竭大鼠心室肌的表达变化
肌球蛋白是心肌粗肌丝的主要成分,由两条重链(Myosin Heavy Chain,MHC)和两对轻链(Myosin Light Chain,MLC)构成.MLC包括两条基本轻链和两条调节性轻链( Myosin Regulatory Light Chain,MRLC,MYL2),既往多认为MHC异常是导致心肌肥厚、心衰的重要原因,而MYL2仅是MHC的辅助装置,在心肌肥厚的发生过程中起次要作用.然而,近的研究显示,MYL2也可能参与慢性心衰(Chronic Heart Failure,CHF)的发生、发展[1,2].本研究通过制作腹主动脉缩窄大鼠慢性心衰模型,观察MYL2在心室肌中的表达,探讨其在CHF发生中的作用.
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肌性斜颈分型及透射电镜的观察
本文报告采用胸锁乳头肌之胸骨头及锁骨头切断术治疗肌性斜颈49例,同时于胸骨头取材行病理学检查及分型.该分型对治疗方法的选择和预后的估计有一定意义.并通过电镜观察进一步阐明了胸锁乳突肌僵直的机理.
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小鼠抗人Myosin Va多克隆抗体的制备和鉴定
目的:制备Myosin Va多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具.方法:PCR扩增编码人Myosin Va C末端(MyoVaCT)278个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半糖苷(IPTG)诱导表达His-MyoVaCT融合蛋白.经电泳纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性.结果:成功构建了pET28a/MyoVaCT原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白His-MyoVaCT,纯化蛋白免疫小鼠后产生的Myosin Va多抗可特异检测细胞内源性Myosin Va的表达及定位情况,同时能特异识别细胞内外源表达的Myosin Va分子.结论:获得了效价和特异性都良好的Myosin Va抗体,适合应用于Myosin Va的检测.
