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重楼皂苷Ⅰ诱导G2/M期阻滞及干扰微管结构抗结肠癌HCT116细胞作用机制
目的:探讨重楼皂苷Ⅰ (PPI)对人结肠癌HCT116细胞周期的影响,并研究其作用机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测PPI对HCT116细胞的体外抑制活性;采用Hoechst33258染色法观察PPI对HCT116细胞核数量的影响;采用流式细胞仪检测PPI对HCT116细胞周期的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶(CDC2)和细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(CDC25C)蛋白的表达和活性,利用细胞免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜检测PPI对HCT116细胞微管的影响.结果:PPI以剂量～时间依赖的方式抑制HCT116的体外增殖,Hoechst 33258染色发现PPI处理组双核细胞数量明显增加(P ＜0.05,P＜0.01);将其细胞周期阻滞于G2/M期;PPI未能抑制G2/M期相关蛋白CDC2,CDC25C的表达和活性,却有促进作用;PPI可导致细胞微管结构紊乱.结论:PPI会导致HCT116细胞阻滞在G2/M期,其作用机制与干扰细胞内微管结构有关.
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健脾消癌方抑制结肠癌增殖的作用机制
目的:观察健脾消癌方对结肠癌HCT116细胞中微小RNA-21(microRNA-21,miR-21),第10号染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)表达的影响,探讨健脾消癌方抑制结肠癌转移的可能作用机制.方法:10％,15％,20％健脾消癌方含药血清处理HCT116细胞后,实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测miR-21,PTEN mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN蛋白的表达水平.结果:与空白组比较,健脾消癌方低剂量组miR-21 mRNA相对表达量降低,PTEN mRNA相对表达量升高,但差异无统计学意义;健脾消癌方中剂量组miR-21mRNA相对表达明显降低,PTEN mRNA相对表达明显升高(P＜0.05);健脾消癌方高剂量组miR-21 mRNA相对表达量显著降低,PTEN mRNA相对表达量显著升高(P＜0.01);与健脾消癌方中、低剂量组比较,健脾消癌方高剂量组miR-21 mRNA相对表达量明显降低,PTEN mRNA相对表达量明显升高(P＜0.05).与空白组比较,健脾消癌方中、低剂量组PTEN蛋白相对表达量升高,差异无统计学意义;与空白组比较,健脾消癌方高剂量组PTEN蛋白相对表达量明显上升(P＜0.05);与健脾消癌方中、低剂量组比较,健脾消癌方高剂量组PTEN蛋白相对表达量明显升高(P＜0.05).结论:健脾消癌方可能通过降低miR-21的表达,上调miR-21靶基因PTEN蛋白表达抑制结肠癌的增殖.
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重楼皂苷Ⅰ对结肠癌HCT116细胞凋亡及Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白表达的影响
目的:观察重楼皂苷Ⅰ (polyphyllin Ⅰ,PPⅠ)对结肠癌HCT116细胞凋亡及凋亡相关因子Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax),B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2),半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表达的影响,探讨重楼皂苷Ⅰ抑制结直肠癌转移的可能作用机制.方法:Cell counting kit-8(CCK-8)法检测12,24,48 h的细胞生长抑制作用,流式细胞术检测不同浓度的重楼皂苷Ⅰ对HCT116细胞凋亡的影响,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关因子Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白的表达.结果:重楼皂苷Ⅰ可抑制对HCT116细胞生长,呈一定的浓度、时间依赖性;可促进HCT116细胞凋亡,呈一定的浓度依赖性.与空白组、重楼皂苷Ⅰ低浓度组比较,重楼皂苷Ⅰ高浓度组Bax,剪切的半胱天冬酶-3蛋白(cleaved Caspase-3)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05),未剪切的半胱天冬酶-3(pro-Caspase-3)蛋白表达无明显变化.结论:重楼皂苷Ⅰ可抑制HCT116细胞生长,诱导HCT116细胞凋亡,且其诱导HCT116细胞凋亡的机制可能与其降低线粒体途径相关的细胞凋亡因子Bcl-2表达,升高Bax表达,并上调线粒体通路下游的Caspase-3蛋白相关.
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斑蝥素与培美曲塞对结直肠癌HCT116细胞的联合作用
目的:探究斑蝥素(cantharidin,CTD)与培美曲塞(pemetrexed,MTA)联合用药对HCT116细胞产生的影响.方法:应用长时间细胞观察及功能分析系统(IncuCytTM ZOOM)及克隆形成实验,分析两药联合对结直肠癌HCT116细胞生长增殖的影响;应用流式细胞术检测两药联合对结直肠癌HCT116细胞凋亡的影响;采用蛋白免疫印迹法检测两药联合对HCT116细胞半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)蛋白表达的影响;应用β-半乳糖苷酶衰老染色实验检测两药联合对结直肠癌HCT116细胞衰老的影响;应用CompuSyn软件计算联合作用指数(CI).结果:与MTA单药组相比,MTA与CTD联合用药能够显著增加对HCT116细胞的生长抑制率(P＜0.01);显著增加凋亡水平(P＜0.01);明显增加衰老水平(P＜0.05);显著减少pro-Caspase-3的表达量,增加cleaved-PARP的表达量(P＜0.01).同时,CompuSyn软件计算的CI＜1,表明两药具有协同作用效果.结论:MTA与CTD具有良好的联合作用效果,能够通过诱发HCT116细胞凋亡以及衰老来抑制细胞的生长增殖,发挥抗肿瘤作用.
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sFRP2和Wnt/β-catenin通路在结直肠癌发生发展中的作用
目的 研究分泌型卷曲蛋白2(Secreted Frizzled-related proteins 2,sFRP2)与Wnt/β-catenin通路在结直肠癌发生发展中的作用.方法 首先对正常结直肠黏膜组织和结直肠癌组织行免疫组化实验,检测sFRP2及 β-catenin的表达水平和阳性率.其次通过质粒转染,使得sFRP2在HCT116细胞中的表达上调,通过Western blot实验验证,然后行CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验,分析sFRP2表达上调后对细胞增殖、迁移和侵袭的影响.结果 正常结直肠黏膜组中sFRP2阳性表达率显著高于结直肠癌组(χ2=35.902,P=0.000).相反,结直肠癌组中 β-catenin膜表达缺失率和异位表达率显著高于正常结直肠黏膜组(χ2=23.149,P=0.000;χ2=27.002,P=0.000).sFRP2阳性表达、β-catenin膜表达缺失、异位表达与肿瘤组织分化明显相关(χ2=5.420,P=0.020;χ2=6.472,P=0.011;χ2=7.158,P=0.007),而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移无关(P>0.05).sFRP2的阳性率与 β-catenin的膜表达缺失率及异位表达率呈负相关,β-catenin的膜表达缺失率和异位表达率呈正相关.转染后sFRP2及 β-catenin表达水平显著升高(t=25.430,P=0.001;t=15.000,P=0.001).sFRP2转染组与对照组及空载质粒组相比,细胞增殖速度及迁移速度明显减慢(t=16.890,P=0.001;t=7.206,P=0.002).与对照组相比,sFRP2转染组透膜细胞数明显少于对照组(t=25.459,P=0.001),细胞侵袭能力显著下降.结论 sFRP2与Wnt/β-catenin通路相互作用,在结直肠癌的发生发展中起着重要作用.sFRP2的上调明显抑制了HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭.
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JTC-801抑制结肠癌增殖迁移和促进凋亡机制探讨
目的 JTC-801是孤啡肽受体NOP[Nociceptin/orphanin FQ(N/OFQ)peptide]受体拮抗剂,适用于与神经损伤相关的神经性疼痛和异常性疼痛,在肿瘤中的研究鲜见.本研究探讨JTC-801对结肠癌HCT116及HT-29细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响,并探讨相关机制.方法 采用JTC-801加药处理HCT116及HT-29细胞,用CCK8法、Transwell实验和细胞流式凋亡检测实验分别检测HCT116细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡;采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白以及PI3K信号通路相关蛋白表达.结果 CCK8实验表明,JTC-801显著抑制了HCT116及HT-29细胞增殖能力,并呈一定的剂量依赖性和时间依赖性.Transwell实验结果表明,10μmol/L JTC-801明显抑制了HCT116细胞迁移能力,与对照组迁移细胞数分别为44±2和96±5,t=16.72,P=0.0001;也抑制了HT-29细胞迁移能力,与对照组迁移细胞数分别为45±4和93±7,t=10.32,P=0.005.同样10μmol/L JTC-801显著抑制了HCT116细胞,与对照组穿膜细胞数分别为21±5和43±3,t=6.54,P=0.0028;也抑制了HT-29细胞,与对照组穿膜细胞数分别为23±3和40±2,t=8.17,P=0.0012.细胞流式凋亡检测实验结果表明,10μmol/L JTC-801促进HCT116细胞凋亡,凋亡率为(13.74±0.42)％和(4.73±0.33)％,t=29.23,P<0.001;也促进HT-29细胞凋亡,凋亡率为(18.59±0.39)％ 和(8.51±0.57)％,t=25.28,P<0.001.且抗凋亡相关蛋白Bcl-2明显下降,同时促凋亡蛋白Bax及Active Caspase3蛋白水平则显著上升,P<0.05;10μmol/L JTC-801还显著抑制了p-Akt、p-mTOR及下游分子p70s6k蛋白的表达水平,均P<0.01.结论 JTC-801可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,对结肠癌的发生发展进程产生重要作用.其作用可能通过影响PI3K信号通路活化实现.
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移植性人结直肠癌动物模型的建立
目的 建立稳定的移植性人结直肠癌动物模型.方法 以BALB/c裸鼠为研究对象,按随机数字表法分为原位接种组和皮下接种组,分别经直肠原位(使用自制接种器)和右侧腋窝皮下接种0.1 ml细胞密度为2×107/ml的人结直肠癌HCT116细胞悬液,观察60 d,比较两种造模方法的成瘤情况及肿瘤生长情况.结果 直肠原位接种组18只裸鼠全部成瘤,成瘤率为100％,平均瘤质量为(2.78±1.86)g,平均存活时间为(45.00±11.99)d;皮下接种组18只裸鼠中5只成瘤,成瘤率为27.78％,平均瘤质量为(1.74±0.82)g,平均存活时间为(60.00±0.00)d.结论 采用自制接种器将0.1 ml细胞密度为2× 107/ml的人结肠癌细胞HCT116接种于BALB/c裸鼠直肠原位可成功建立原位移植性人结直肠癌动物模型.
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5-氟尿嘧啶诱导结肠癌细胞凋亡与NF-κB活化及uPA表达的关系
目的 研究5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导人结肠癌细胞(HCT116)凋亡与核转录因子-κ B(NF-κ B)活化以及尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)表达的关系,并观察吡咯烷二硫氨基甲酸盐(PDTC)抑制NF-κ B活化对5-Fu诱导结肠癌细胞凋亡及uPA表达的影响.方法 采用流式细胞仪Annexin V-FITC法检测结肠癌细胞HCT116凋亡;采用免疫组织化学方法半定量分析HCT116细胞NF-κB及uPA表达的动态变化.结果 5-Fu在诱导HCT116细胞凋亡的同时有NF-кB活化,1μmol/L PDTC能显著增加5-Fu诱导HCT116细胞凋亡及抑制5-Fu诱导的HCT116细胞NF-κB活化作用(P＜0.05),uPA变化与NF-κB一致.结论 5-Fu在诱导HCT116细胞凋亡的同时活化了NF-κ B,uPA表达亦随之增强;PDTC在抑制5-Fu诱导的HCT16细胞NF-κB活化的同时增强了5-Fu诱导细胞凋亡的作用,uPA表达也相应下降.
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ZNF331过表达对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响
目的 研究ZNF331过表达对结肠癌HCT116细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法 构建ZNF331过表达的慢病毒载体Flag-pLV-Neo-ZNF331,并进行包装,感染 HCT116/p53 +/+(p53野生型)和HCT116/p53 -/-(p53缺陷型)细胞,通过Western印迹法鉴定建立ZNF331稳定过表达的细胞株.分别通过细胞增殖实验、集落形成实验、DAPI染色、流式细胞仪分析ZNF331对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响.通过免疫沉淀实验、报告基因实验和实时(real-time)PCR检测ZNF331与p53相互作用、对p53转录活性和p53凋亡相关靶基因表达的影响.结果 成功构建ZNF331过表达的慢病毒载体;建立ZNF331稳定过表达的HCT116细胞克隆;ZNF331对HCT116/p53 +/+细胞增殖无明显影响,但能抑制HCT116/p53 -/-细胞增殖(P<0.01);ZNF331与p53存在相互作用,与空载对照细胞相比,ZNF331能梯度抑制p53转录活性,且能抑制p53凋亡相关靶基因Puma和p53AIP1的mRNA表达水平(P<0.05);ZNF331能抑制p53诱导的细胞凋亡(P<0.01).结论 ZNF331过表达对结肠癌细胞增殖的影响依赖p53状态;且能通过与p53相互作用,抑制p53转录活性而抑制结肠癌细胞凋亡.
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MKK7/JNK途径促进HCT116细胞恶性生长
目的 观察MKK7/JNK途径对HCT116细胞恶性生长的影响.方法 建立稳定敲低MKK7与JNK的细胞株,Western印迹实验检测JNK与MKK7的表达,集落形成技术检测HCT116细胞体外增殖.通过裸鼠荷瘤实验分析稳定敲低MKK7与JNK细胞株体内恶性生长能力.结果 稳定敲低MKK7与JNK细胞株集落形成能力显著降低,成瘤能力明显减弱.结论 MKK7/JNK途径促进了HCT116细胞恶性生长.
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MLN4924与5-氟尿嘧啶协同杀伤人结肠癌HCT116细胞的研究
目的 探讨MLN4924与5-氟尿嘧啶(5-FU)单用及联用对人结肠癌HCT116细胞活力的影响及其发挥作用的可能途径.方法 细胞活力实验检测两药单用及联用对HCT116细胞活力的影响;应用中效原理计算两药联合应用的联合指数,判断药物联用的效果;将HCT116细胞分为对照组、MLN4924组、5-FU组及联用组,药物作用后,流式AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测各组细胞凋亡情况;蛋白质印迹实验检测各组细胞Cleaved PARP、Cleaved caspase3的表达水平.结果 随着MLN4924和5-FU浓度的增加,HCT116细胞活力逐渐降低;MLN4924与5-FU联用时,抑制效果明显强于单药作用(P<0.001),各联合用药组的联合指数均<1,提示两药联用起协同效果;与对照组相比,单用及联用均可显著促进HCT116细胞的凋亡(P<0.001),且联用效果显著优于单用(P<0.01);与流式AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测细胞凋亡的结果相一致,联用组Cleaved PARP、Cleaved caspase3蛋白表达较对照组及单用组明显升高.结论 MLN4924与5-FU通过促进细胞凋亡而发挥协同抑制人结肠癌HCT116细胞活力的作用.
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STAT3磷酸化抑制剂隐丹参酮提高5-FU诱导的结直肠癌细胞凋亡
目的 探究结直肠癌细胞中利用信号转导蛋白和转录激活因子3(STAT3)磷酸化抑制剂隐丹参酮(CTS)抑制STAT3 705位点磷酸化对5-氟尿嘧啶(5-FU)效果的影响.方法 采用Western印迹法检测5株结直肠癌细胞中STAT3的磷酸化水平,挑选磷酸化程度高的2株细胞进行后续实验研究.采用Western印迹法检测5-FU处理后结直肠癌细胞STAT3磷酸化水平的变化.应用MTT实验评价5-FU与CTS联合处理结直肠癌细胞对细胞活性影响.利用流式细胞仪检测5-FU与CTS联合处理细胞后对细胞凋亡的影响,同时利用Western印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl2的变化情况.结果 5-FU能够降低结直肠癌细胞STAT3 705位点磷酸化水平,利用CTS抑制STAT3磷酸化极大的增强了5-FU的作用效果,降低了结直肠癌细胞活性,促进了细胞凋亡.同时进一步机制研究表明CTS与5-FU联合作用降低了Bcl2蛋白水平.结论 结直肠癌细胞中,利用STAT3磷酸化抑制剂CTS抑制STAT3磷酸化水平能够明显提高5-FU的作用效果.
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何首乌R50部位诱导人结直肠癌细胞凋亡的作用机制
目的 考察何首乌R50部位对体外培养的人结直肠癌细胞活性的影响,探究其对人结直肠癌细胞周期和凋亡的作用.方法 体外培养人结直肠癌HT29和HCT116细胞24 h,加入何首乌R50部位50～300 mg·L-1继续培养24,48和72 h,MTT法检测细胞存活率;何首乌R50部位50,100和200 mg·L-1分别与HCT116和HT29细胞作用48 h,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;何首乌R50部位100 mg·L-1与HCT116和HT29细胞作用48 h,Giemsa染色检测细胞及核的变化,Western蛋白质印迹法检测胱天蛋白酶原3和Pdcd4蛋白的表达.结果 何首乌R50部位对HCT116和HT29细胞存活抑制作用显著,呈时间和浓度依赖性;不同浓度何首乌R50部位与HCT116和HT29细胞作用48 h后,对细胞周期的影响均不显著;但随着何首乌R50部位浓度的增加,细胞凋亡率明显增加,200 mg·L-1组HCT116细胞凋亡率由对照组的(5.85±0.35)%增加至(27.65±1.62)%(P<0.05),HT29细胞的凋亡率由(10.25±0.77)%增加至 (35.35±0.35)%(P<0.05);何首乌R50部位100 mg·L-1作用HCT116和HT29细胞48 h,Giemsa染色可见部分细胞出现细胞固缩、核染色质凝集、凋亡小体形成等细胞凋亡形态;胱天蛋白酶原3和Pdcd4蛋白表达均下降.结论 何首乌R50部位主要通过诱导人结直肠癌HCT116和HT29细胞凋亡而使其存活率下降,并通过胱天蛋白酶依赖信号通路诱导人结直肠癌细胞凋亡,Pdcd4蛋白表达下调可能与其相关.
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槲皮素诱导肿瘤细胞P53非依赖的G2/M周期阻滞和凋亡
目的 研究槲皮素对肿瘤细胞的增殖、周期和凋亡的影响.方法 用槲皮素12.5,25,50和100μmol·L-1,分别作用于人肝癌HepG2和Hep3B细胞、人乳腺癌MDA-MA-231细胞、人结肠癌HCT116 p53野生型(HCT116 p53WT)和p53敲除型(HCT116 p53KO)细胞12,24和48 h.荧光显微镜观察细胞形态变化;MTT法测定细胞存活率;采用Hoechst33258染色观察细胞核染色质的变化;采用流式细胞术检测细胞周期的变化;Western印迹法检测胱天蛋白酶3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白水平的变化.结果槲皮素对肿瘤细胞增殖的抑制作用显著且呈浓度(rHepG2=0.972,P<0.01;rHep3B=0.959,P<0.01;rMDA-MB-231=0.979,P<0.01;rHCT116p53WT=0.983,P<0.01;rHCT116p53KO=0.980,P<0.01)和时间(rHepG2=0.974,P<0.01;rHep3B=0.956,P<0.01;rMDA-MB-231=0.959,P<0.01;rHCT116p53WT=0.971,P<0.01;rHCT116p53KO=0.988,P<0.01)依赖性,与细胞对照组相比,槲皮素处理组细胞数量明显减少.槲皮素诱导G2/M周期阻滞(P<0.01);镜下观察见核染色质浓缩和碎裂等典型的凋亡特性(P<0.01).Western印迹法结果显示,胱天蛋白酶3蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),活化的胱天蛋白酶3表达水平无显著变化,PARP表达水平明显降低(P<0.01),活化的PARP明显升高(P<0.01);在加入泛胱天蛋白酶抑制剂后,与槲皮素单独作用相比,胱天蛋白酶3和PARP蛋白表达水平升高,活化的PARP表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05).结论 槲皮素能通过诱导P53非依赖性的G2/M细胞周期阻滞和细胞凋亡,从而实现对肿瘤细胞增殖的抑制作用.
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角蛋白18磷酸化与奥沙利铂作用下结肠癌HCT116细胞凋亡的关系
目的 探讨在化疗药物作用下角蛋白18(K18)磷酸化与结肠癌HCT116细胞凋亡的关系.方法 以不同浓度的奥沙利铂作用于HCT116细胞,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术和钙黄绿素-AM/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)法检测细胞凋亡情况,免疫印迹(western blotting)方法检测K18磷酸化表达水平;HCT116细胞分别转染绿色荧光蛋白(GFP)、野生型K18和33、52丝氨酸(Ser33A、Ser52A)磷酸化位点突变的K18质粒后,用奥沙利铂处理,Annexin V-FITC/PI和Calcein-AM/PI法分析K18及其突变对细胞凋亡的影响.结果 奥沙利铂可以使HCT116细胞发生明显的凋亡,而且凋亡比例随着药物浓度的增加而升高,经20、60、100 μmol/L奥沙利铂处理后,细胞较对照组均出现凋亡增加,依次为(15.6±3.1)％、(30.1±4.9)％和(62.6±6.8)％,两两比较差异均有统计学意义(P均＜ 0.05);K18的Ser33、Ser52磷酸化水平也随着药物浓度的增加而增加;单纯质粒转染的各细胞组之间的凋亡率差异均无统计学意义(P＞0.05),但经过奥沙利铂处理后,Ser33A和Ser52A质粒转染的HCT116细胞的凋亡率[(27.3±6.7)％和(31.2±8.1)％]明显低于GFP和K18质粒转染的细胞凋亡率[(40.5±4.8)％和(50.9±6.3)％,P＜0.05],转染K18质粒组的HCT116细胞的凋亡率高于GFP转染对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);Ser33A和Ser52A质粒转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 K18 Ser33和Ser52磷酸化水平随着细胞凋亡水平的增加而增加;K18过表达提高了HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性,而抑制K18 Ser33和Ser52的磷酸化可以减少化疗药物作用下结肠癌细胞的凋亡.
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绿原酸抑制结肠癌HCT116细胞的机制研究
目的 探讨绿原酸对结肠癌HCT116细胞抑制作用的机制.方法 以绿原酸处理HCT116细胞,未处理组为对照组,通过基因表达谱芯片筛选出处理前后的差异表达基因,应用Real-time PCR技术对胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、肺腺癌转移相关转录本1 (MALAT1)、雄性性别决定基因相关高迁移率族盒基因(SOX4)、N-myc下游调节基因1(NDRG1)4个基因进行验证,Western blotting法检测上调基因中NDRG1的蛋白表达水平.结果 基因表达谱芯片检测表明,经绿原酸处理后的结肠癌细胞中表达上调的基因为161个(差异倍数大于2),表达下调的基因为64个(差异倍数小于0.5).这些基因主要涉及细胞信号转导、生物过程、细胞组分等功能.Real-time PCR检测证实IGFBP3、NDRG1基因经绿原酸处理后表达明显上调(P＜0.05).Western blotting检测表明,经绿原酸处理后NDRG1基因的蛋白表达水平上调.结论 基因表达谱芯片结合Real-time PCR技术筛选出绿原酸处理后的差异表达基因,为揭示绿原酸抑制结肠癌细胞的作用机制提供依据.
关键词： 绿原酸 结肠癌 HCT116细胞 基因表达谱芯片 N-myc下游调节基因1 -
含氮查尔酮类细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的合成及抗癌活性研究Ⅳ
目的 寻找活性更好的类黄酮细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)抑制剂.方法 利用Mannich反应制得8个查尔酮类黄酮.结果与结论 目标化合物的结构经1R、1 H-NMR、质谱确证,并测定了化合物对CDK1的抑制活性以及对HCT116肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性,其中有7个化合物对CDK1抑制活性高于阳性对照flavopiridol,所有化合物对HCT116肿瘤细胞均显示出较强的抑制活性.
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靶向CK2α基因的siRNA对结肠癌HCT116细胞生长抑制作用及其机制
目的：探讨RNA干扰酪蛋白激酶2（CK2α）基因表达后对 HCT116细胞生长的抑制作用并阐明其作用机制。方法：针对CK2α的 mRNA序列设计 CK2α-siRNA序列，将体外培养的 HCT116细胞分为正常对照组（未转染）、阴性对照组（转染siRNA）和CK2α-siRNA组（转染CK2α-siRNA），应用Lipofectamine 2000进行转染，利用 Western blotting 法检测CK2α、cyclin H、P53和P21蛋白表达水平；应用 MTT法检测各组 HCT116细胞增殖；采用流式细胞术检测细胞周期时相的分布。结果：与阴性对照组比较， CK2α-siRNA组 CK2α和细胞周期蛋白 cyclin H的表达水平明显降低（P＜0.01），P53蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05），P21蛋白表达水平则明显升高（P＜0.01）；MTT检测，与阴性对照组比较，转染48和72 h，CK2α-siRNA组细胞存活率明显降低（P＜0.01）；流式细胞术分析，与阴性对照组比较，CK2α-siRNA组 S期细胞所占比例逐渐减少（P＜0.01），G1期细胞则明显增加（P＜0.01），细胞滞留在 G1期。结论：RNA干扰CK2α表达能够抑制 HCT116细胞增殖，发生 G1期阻滞；其机制可能与 RNA干扰CK2α表达后 cyclin H表达下调及P53活性恢复有关。
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野生型着丝粒蛋白-E基因沉默对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响
目的 利用RNA干扰技术下调野生型着丝粒蛋白E(Wild type centromere protein E,CENP-EWT)基因的表达,观察CENP-EWT基因沉默对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响.方法 将HCT116细胞分为空白对照组、空载体转染组和CENP-EWT shRNA转染组,转染48 h后,采用巢式PCR检测细胞中CENP-EWT基因mRNA的转录水平;MTT法检测细胞的增殖活力;Hoechst法检测细胞的凋亡比例;Transwell小室试验检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 与空白对照组和空载体转染组相比,CENP-EWT shRNA转染组可有效抑制CENP-EWT基因的转录水平(P＜0.05);CENP-EWT shRNA转染组细胞的增殖活力明显下降(P＜0.05);细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P＜0.01).结论 CENP-EWT基因沉默能够抑制人结肠癌HCT116细胞增殖,诱导细胞凋亡,但同时能增强细胞的迁移和侵袭能力.
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冬凌草甲素对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其机制研究
目的:研究冬凌草甲素(ORI)对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其可能机制.方法:以体外培养的HCT116细胞为研究对象,给予不同浓度(0、2.5、5、10、20 μ M)ORI处理HCT116细胞不同时间(0、24、48、72h),通过MTT法检测其对HCT116细胞增殖的影响,DAPI染色观察其对细胞核的形态的影响,western blot检测细胞内β-catenin、c-myc蛋白表达的变化.结果:①ORI可显著抑制HCT116细胞的增殖,且此作用随着浓度和作用时间的增加或延长而增强(P＜0.05).②ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞核固缩的百分率随药物作用浓度的增加而增加.③5、10、20μM ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞内的β-catenin、c-myc蛋白水平均显著下调,且随着ORI浓度的增加逐渐减少.结论:ORI能以浓度和时间依赖性的方式抑制HCT116细胞的增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关.
