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地高辛抑制豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATP酶和人胚肾上皮细胞系HERG钾通道电流
强心苷类药对Na+,K+-ATP酶的作用在低浓度时为兴奋、在高浓度时呈抑制作用[1].应用膜片钳技术观察地高辛(Digoxin)对豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATP酶电流(Ip)的作用还未见报道.此外,由于很多药物的心脏不良反应是通过抑制人ether-a-go-go-related基因(HERG)编码的快速激活的延迟整流钾通道(Ikr)而引起QT间期延长和尖端扭转性室速(TdP)[2].本研究初步探讨地高辛对豚鼠心室肌细胞Ip电流和对人胚肾上皮细胞系(human embryonic kidney cell line,HEK-293)上HERG/Iκr钾通道的影响及地高辛治疗心功能不全和引起心脏毒性反应的机制.1材料与方法1.1动物、细胞系、质粒来源及地高辛配制:普通级豚鼠,8～12周龄,体质量250 ～ 300 g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供[合格证号SCXK(鄂)2004-007].HEK-293细胞,中国科学院上海生科院细胞资源中心.编码Ikr的HERG基因的真核细胞表达载体pcgi-EGFPHERG(南京师范大学生命科学院张朝教授馈赠).地高辛(郑州大学药学院药物化学研究所提供)溶于二甲基亚砜中配制成10 mmol/L的母液.
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酪氨酸的磷酸化及去磷酸化对心脏钾离子通道的调控
心脏钾离子通道是人体内广泛存在的、种类多、作用复杂的一类离子通道,并在人类心肌细胞动作电位的各个时程中发挥着重要的作用.近年来由于新兴技术如膜片钳技术、基因突变技术、分子克隆技术等诸多技术的运用和发展,人们对钾离子通道的基因表达、分子结构、生理病理作用及调控机制等方面都有了很深的认识,然而对蛋白磷酸化与去磷酸化对心脏钾离子通道的调控尤其是酪氨酸磷酸化和去磷酸化调控方面的研究却比较少,为此做一简单综述.
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应用酵母双杂交技术筛选HERG钾通道相互作用蛋白
目的 筛选心肌细胞内哪些蛋白质与HERG钾通道存在相互作用.方法 (1)通过PCR方法扩增编码心脏herg基因N端的cDNA片段(HERG-NT,aa l-403)和C端的cDNA片段(HERG-CT,aa 669-1159),分别克隆进入pGBKT7载体,构建pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT诱饵质粒；(2)将被诱饵质粒转化的AH109分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/X-α-Gal平板上,以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因；(3)将已被诱饵质粒转化的AH109分别与预转染于Y187的人类心脏cDNA文库进行酵母双杂交,分离阳性克隆中的cDNA,并测序.结果 (1)成功构建诱饵载体pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT,测序结果表明herg-NT和herg-CT都和“GAL4 DNA-BD-C-Myc”在同一读框,没有PCR引起的突变；(2)“诱饵”蛋白HERG-NT和HERG-CT均未能自我激化报告基因Ade2、Mel1和LacZ,弱激活报告基因His3,应用5mmol/L的3-AT可以有效抑制HERG-NT或HERG-CT所引起的组氨酸表达；(4)经过严格筛选后,发现Caveolin-1、FHL2和PTPN12等15种蛋白与HERG-NT存在相互作用,Myotrophin等8种蛋白与HERG-CT相互作用.结论 成功应用酵母双杂交技术,以HERG钾通道蛋白的氨基端或羧基端为诱饵蛋白,筛选HERG钾通道的相互作用蛋白(Caveolin-1、FHL2、PTPN12,Myotrophin等),这些蛋白质可能与HERG存在相互作用.
关键词： HERG钾通道 蛋白质-蛋白质相互作用 酵母双杂交技术 -
从噬菌体随机七肽库中筛选hERG钾通道亲和肽的研究
目的 获得与hERG钾通道特异性结合的功能性亲和肽.方法 以hERG1a亚基第3个细胞外环(L3)为靶蛋白分子,对噬菌体随机七肽库进行亲和筛选,ELISA法检测噬菌体克隆与靶蛋白的亲和性,使用全自动膜片钳技术观察亲和肽的活性.结果 与结论经过3轮亲和筛选后,随机挑选15个噬菌体克隆对其亲和性做ELISA鉴定,均显示较强的阳性结果.将上述阳性克隆进行DNA测序得到3种不同小肽序列.电生理学研究表明,合成的3个小肽均能显著抑制hERG钾电流,为靶向hERG钾通道抗肿瘤研究提供了新的研究思路.
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利多卡因对hERG钾通道的影响
研究利多卡因对克隆hERG钾通道的作用,探讨其对心脏电生理的影响.利用全细胞膜片钳技术和Western blot技术,观察利多卡因对稳定表达hERG钾通道的HEK 293细胞hERG电流和蛋白表达的影响,同时观察利多卡因对离体兔心脏心电图的影响.结果显示,利多卡因在0.3～1000 μmol·L-1内呈浓度依赖性抑制hERG电流,IC50值为88.63±7.99 μmol·L-1;抑制作用在大于20 mV电压下更明显,不影响通道激活曲线,但具有频率依赖性特点;慢性孵育利多卡因不影响hERG蛋白的表达;利多卡因对QTc间期没有明显影响,但浓度大于100tmol·L-1可减慢心率,延长PR间期以及QRS波.结果表明,尽管利多卡因在较高浓度下具有潜在的hERG电流抑制作用,但并不引起QTc间期延长.
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三七总皂苷对hERG钾离子通道的影响
目的:探讨中药成分三七总皂苷(PNS)对hERG( human ether-a-go-go related gene)钾离子电流的作用.方法:使用全细胞膜片钳技术观察不同浓度PNS对转染hERG通道的HEK293细胞电流活动的影响.结果:100和300μg·mL-1 PNS能够增强转染于HEK293细胞上hERG电流的幅度,并呈时间依赖性.结论:PNS具有增强hERG电流的作用,这种效应可能与PNS影响hERG通道电流的灭活过程有关.
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咪达唑仑对hERG钾通道的作用
目的:观察咪达唑仑对人胚肾上皮细胞(HEK-293)中异源表达的人类相关基因(hERG)钾电流作用及其机制.方法:利用全细胞膜片钳技术,观察咪达唑仑对hERG钾通道的抑制作用,分析其对通道激活、失活动力学过程的影响以及咪达唑仑对Y652A和F656C突变型hERG钾通道的作用.结果:咪达唑仑浓度依赖性地抑制hERG钾电流,其IC50值为(1.31±0.32)μnol/L.1.0μmol/L的咪达唑仑加药前后半数激活电压V1/2由(2.32±0.38)mV变为(-1.96±0.83)mY;加药前后半数失活电压V1/2由(-49.25±0.69)mV变为(-57.53±0.53)mV(P＜0.05),失活曲线左移;与野生型(WT)比较,Y652A和F656C突变型可显著减弱咪达唑仑对hERG通道的阻断作用.结论:咪达唑仑能阻断hERG钾通道,失活速度加快,Y652和F656可能是咪达唑仑与bERG钾通道结合的关键位点.
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HERG钾通道在细胞容量调节中的作用
目的:研究HERG钾通道在细胞容量调节中的作用,并探讨其作用机制.方法:全部试验应用稳定转染HERG-HEK293细胞和HEK293细胞.应用全细胞膜片钳技术记录HERG钾电流.结果:①当HERG-HEK293细胞处于低渗状态,指令电压为0mV时,Istep增加60％(n=12,P＜0.05);如指令电压为+30 mV,Itail增加72.1％(n=11,P＜0.01),增大的HERG电流可被特异性HERG钾电流阻断剂Cisapride(100nM)抑制,Istep被抑制97.2％(n=6,P＜0.01),Itail被抑制174.1％(n=6,P＜0.01).②在低渗状态,指令电压为0 mV时,容量调节性氯通道阻断剂尼氟灭酸(NFA,10 nmol/L)使Istep抑制46.2％(n=12,P＜0.01),Itail抑制48.5％(n=11,P＜0.01);给以容量调节性氯通道阻断剂DIDS 100 μmol/L时,Istep抑制45.9％(n=12,P＜0.01),Itail抑制51.1％(n=11,P＜0.01).结论:HERG通道部分参与调节性细胞容量下降过程.其参与的细胞容量调节与容量调节性氯通道的激活相伴随.
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HERG钾通道对调节性细胞容量下降的作用
目的 研究HERG钾通道在细胞容量调节中的作用,并初步探讨其机制.方法 应用时滞显微摄影技术检测HEK293细胞和HERG-HEK293细胞在不同渗透压时的细胞容量.结果 ①在低渗外液中,经过调节性细胞容量下降(RVD)过程,HEK293细胞RVD率为(77.8±3)%(n=20,P<0.01);HERG-HEK293细胞RVD率为(174±2.6)%(n=20,P<0.01) .容量调节性氯通道阻断剂NFA 10nmol/L、DIDS 100μmol/L,对上述2种细胞RVD过程均有明显抑制作用;②加HERG通道阻断剂Cisapride 100nmol/L后,HERG-HEK293细胞RVD率为(47.4±5)%(n=20,P<0.01).结论 HERG通道可能部分参与细胞容量调节,可能是调节性细胞容量下降的机制.
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shRNA干扰HERG钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤
目的:探讨发卡结构小片段RNA(small hairpin interfering RNA,shRNA)干扰人 ERG(human ether-α-go-go-related gene,HERG)钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤的疗效和作用机制.方法:用真核转录载体 mU6pro构建针对herg基因的发卡状RNA干扰质粒(shRNA-herg). 18只 BALB/c裸小鼠皮下接种成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤模型,当瘤体积达到100 mm3 时随机分成3组,分别为生理盐水组(Ⅰ)、对照质粒组(Ⅱ)、干扰质粒组(Ⅲ).各组瘤内分别注射生理盐水、对照质粒、干扰质粒,以后每7 d注射1次,连续15 d.观察各组肿瘤生长情况,RT-PCR测定肿瘤组织 herg 基因 mRNA 含量变化,免疫组化检测肿瘤组织中 HERG钾通道蛋白变化.结果:经治疗后,第Ⅲ组肿瘤生长受到明显抑制,Ⅱ、Ⅲ组抑瘤率分别为3.04%和29.78%(P＜0.05).肿瘤组织内herg 基因 mRNA含量、HERG钾通道蛋白,Ⅲ组较Ⅰ、Ⅱ组表达减弱.结论:构建的shRNA干扰质粒可通过靶向性抑制herg基因及其编码的HERG钾通道蛋白的表达,有效地抑制人成神经细胞瘤的生长.
关键词： 发卡结构小片段RNA HERG钾通道 成神经细胞瘤 RNA干扰 -
新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道电流作用研究
目的 探讨新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道电流的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术,记录HEK293细胞异源表达的hERG钾电流,观察新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道电流的抑制作用.结果 新型酪氨酸激酶抑制剂能作用于hERG钾通道,并以浓度依赖的方式抑制hERG钾电流,半数抑制浓度(IC50)分别为PA1101(10.80±3.01)μmol/L,PA1102(9.55±1.81)μmol/L,PA1103(1.69±0.26) μmol/L,PA1104(1.17±0.49) μmol/L,PA1105(0.08±0.02)μmol/L,PA1106 (0.001 9±0.000 7)μmol/L.结论 新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道有较强烈的阻断作用,建议结合临床使用剂量与血药浓度进行安全性评估.
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红霉素的心脏安全性研究进展
红霉素是一种大环内酯类抗生素, 临床应用广泛, 但在使用过程中可能会引发较为严重的心脏毒性, 主要表现为QT间期延长, 尖端扭转型室性心动过速TdP (Torsades de pointes), 甚至心脏猝死等.红霉素对心脏hERG (Human ether-a-go-go-related gene) 钾通道的抑制作用是引发心脏毒性的重要机制, 多种因素会增加红霉素心脏毒性发生的几率.随着红霉素在临床中的广泛使用, 其心脏安全性引起广泛关注.文章综述了红霉素心脏安全性方面的研究进展, 评估了使用中存在的危险因素, 为临床中能够更加合理地使用红霉素提供参考.
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Caveolin-1对心脏HERG钾通道功能调控作用的研究
目的 既往研究发现caveolin-1参与了多种心脏离子通道的调控作用,但对心脏HERG钾通道是否具有调控作用,则未见报道.研究caveolin-1对心脏HERG钾通道功能的调控作用.方法 ①基因转染:应用Lipofectamine 2000将pcDNA3.0-caveolin-1质粒和pcDNA3.0-herg转染HEK293细胞,通过G418筛选获得稳定表达细胞株;②脂筏破坏:通过在培养液中加入10mmol/L的甲基-β-环糊精,去除HEK293/HERG细胞膜上的脂筏;③Caveolin-1表达抑制:应用siRNA转染HEK293/HERG细胞抑制caveolin-1表达;④Caveolin-1过度表达:将pcDNA3.0-herg转染HEK293/caveolin-1细胞株,获得caveolin-1过度表达的HEK293/HERG细胞;⑤应用膜片钳技术记录经不同处理后的HERG通道电流.结果 ①细胞膜脂筏破坏与caveolin-1表达抑制均能显著增大HERG钾通道电流幅度和显著加速尾电流去激活速率;②Caveolin-1过度表达则显著减小了HERG通道电流的振幅并显著缓慢了尾电流的去激活速率.结论 Caveolin-1对心脏HERG钾通道的功能具有负性调控作用.
关键词： HERG钾通道 Caveolin-1 RNA干扰 脂筏 膜片钳技术 -
应用膜片钳技术研究豆腐果苷对hERG钾通道电生理功能的影响
目的:探讨豆腐果苷对hERG钾离子电流的影响及潜在心脏毒性.方法:使用稳定转染hERG基因的CHO细胞,通过全细胞膜片钳技术检测不同浓度豆腐果苷对hERG通道电流活动的作用.结果:豆腐果苷对hERG钾通道的IC50约为47 μmol/L,比临床常规剂量下人体内峰浓度高1 000倍以上.结论:临床常用剂量下,豆腐果苷发生与hERG通道抑制作用相关的心脏安全性问题的可能性非常小.
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卡维地洛对HERG钾通道电生理功能及蛋白表达的影响
目的 探讨卡维地洛对稳定转染HERG基因的HEK(human embryonic kidney)293细胞上的HERG钾通道的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术记录在HEK293细胞上稳定表达的HERG钾通道的电流和动力学曲线(激活、失活、复活和去激活 ),研究不同浓度卡维地洛对HERG电流及动力学的影响;用Western blot技术定量的观察不同浓度卡维地洛对定位于HERG-HEK细胞膜上的HERG钾通道蛋白表达的影响.结果卡维地洛(10、100 nmol*L-1,1、10 μmol*L-1)浓度依赖性的抑制HERG步阶电流(Istep)及其尾电流(Itail).由Hill方程得出IC50为539.6 nmol*L-1,Hillslope为-0.64.1 μmol*L-1卡维地洛作用后瞬时失活、去激活时间常数明显降低(P<0.05,n=10),而激活、失活、复活动力学无明显改变;Western blot检测结果显示卡维地洛组与无加药对照组HERG蛋白的表达无差别.结论卡维地洛通过影响通道的开放状态抑制HERG钾电流,加速瞬时失活和去激活动力学,对HERG蛋白的表达及成熟无影响.
关键词： 卡维地洛 HERG钾通道 膜片钳技术 Westernblot技术 -
白藜芦醇对HERG钾通道电生理功能的影响
目的 探讨白藜芦醇对稳定转染HERG基因的HEK293细胞上HERG钾通道的影响,进一步了解其抗心律失常的作用机制.方法 传代得到单个HERG-HEK细胞,应用全细胞膜片钳技术记录HERG-HEK细胞上的HERG钾电流和动力学曲线(激活、失活、复活和去活化).结果 白藜芦醇(1、10、100 μmol·L-1)浓度依赖性的抑制HERG步阶电流(IHERG)及其尾电流(IHERGtail),0 mV电压下1μmol·L-1白藜芦醇抑制 IHERG25.3%±9.4%,IHERGtail 23.6 %±11%;10μmol·L-1白藜芦醇抑制 IHERG28%±8.4%,IHERGtail 28.8 %± 9.1%;100μmol·L-1白藜芦醇抑制IHERG 43.7%±1.5%,IHERGtail 47.9%±11%(P＜0.05,n=12).100μmol·L-1白藜芦醇作用后失活时间常数减小,失活速率变快;去活化时间常数明显减小(P＜0.05,n=12).激活、瞬时失活和复活动力学没有明显变化.结论 白藜芦醇通过影响通道的开放状态和失活状态抑制HERG钾电流,从而使得心肌细胞复极时间延长,改善快速性心律失常.
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木兰花碱对HERG钾通道蛋白表达的影响
目的 探讨木兰花碱抗心律失常的作用及机制.方法 将低浓度(1、3μmol/L)及高浓度(10、30 μmol/L)木兰花碱分别作用于转染HERG基因重组载体的HEK-293细胞,采用Western blot法、免疫荧光化学染色法分别定量、定性检测HEK-293细胞中HERG钾通道蛋白(以下简称HERG蛋白)表达.结果 低浓度木兰花碱对HERG蛋白表达无明显影响；高浓度木兰花碱作用后HERG蛋白表达明显受抑.结论 高浓度木兰花碱能够抑制HERG蛋白表达,此可能为木兰花碱抗心律失常的作用机制.
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hERG钾通道在肿瘤发生、发展及靶向治疗中的作用研究进展
herg基因是进化保守的电压门控外向整流钾离子通道的Ether-a-go-go (eag)家族成员之一,其编码的hERG钾通道是一种特殊类型的钾通道,具有内向整流特性.大量研究表明,hERG钾通道选择性表达于多种组织来源的肿瘤细胞,而在相应来源的正常组织细胞中不表达,参与调节肿瘤细胞的发生、发展[1],现将hERG钾通道在肿瘤发生、发展中的作用及设计靶向性hERG钾通道肿瘤治疗的策略进行综述.
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HERG钾离子通道与药物的心血管安全性
Ikr为HERG编码延迟整流钾通道(以下简称HERG钾通道)中的快速成分,在人心肌动作电位正常复极中起关键作用.HERG钾通道既可作为抗心律失常药物的治疗靶点,亦可作为探究一系列药物致心脏毒性的分子靶点,目前已日益成为药物研究的热点.
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依托咪酯对 HEK-293细胞中异源表达的 hERG 钾通道电流的抑制作用
目的：观察依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用及其机制。方法：采用脂质体瞬时转染的方法将野生型hERG（WT-hERG）、突变型Y652A-hERG和F656C-hERG分别转染人胚胎肾细胞HEK-293，应用全细胞膜片钳技术记录依托咪酯对转染后HEK-293细胞表达的hERG钾通道电流的抑制作用以及对激活曲线和失活曲线的影响。结果：依托咪酯可浓度依赖性地抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流，其半数大抑制浓度为（6．41±2．43）μmol／L，对激活曲线和失活曲线无明显影响。与WT-hERG转染的HEK-293细胞相比，依托咪酯对突变体Y652 A-hERG及F656 C-hERG转染的HEK-293细胞内钾通道电流的抑制作用减弱。结论：F656 C可能是依托咪酯抑制hERG钾通道的重要靶点。
