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葡萄糖转运体GLUT1对CD4 T细胞激活和功能发挥至关重要
CD4T细胞激活后会增殖分化为效应性T细胞和调节性T细胞，进而介导免疫反应的发生。在离体状态下，不同亚型的T细胞，其代谢方式对糖酵解和氧化磷酸化的侧重不同，对于T细胞葡萄糖摄取和代谢的在体调控机制目前尚不清楚。尽管在T细胞上有诸多葡萄糖转运体的表达，但是GLUT1缺失选择性损伤胸腺细胞和效应性T细胞的代谢和功能。而静息T细胞在未激活之前都处于正常状态。GLUT1的缺失抑制T细胞葡萄糖摄取和糖酵解，生长和增殖，降低效应性T细胞存活和分化能力。更重要的是，Glut1缺失抑制效应性T细胞扩增以及诱导炎症免疫反应疾病发生的能力。相反的，调节性T细胞的数量并未减少，并且能够正常发挥对效应性T细胞的抑制作用，并不受Glut1表达的影响。这些结果提示在体调控CD4 T细胞激活和效应性T细胞扩增于存活中，对于Glut1的选择性需要。
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微载体技术及其在机体损伤修复中的应用
利用微载体生物反应器获得足够数量的种子细胞一直是组织工程的研究热点。微载体技术较传统平面细胞培养方式具有许多优势，如在短期内能够提高细胞生长数量，简化了以往复杂繁琐的培养过程，大大节省了空间和人力，并且能为细胞生长提供一个更适宜的微环境。近年来，细胞微载体无论在材料种类、制备技术及生物医学应用等方面都获得了极大的进步。除了细胞扩增功能，生物降解微载体还可作为生物支架及药物载体应用于组织工程。将具有生物降解能力的微载体作为细胞和药物的运载工具将其输送至体内，为组织缺损提供了一种全新的治疗途径，因此被广泛应用于创伤修复治疗的研究中。本文就微载体材料、微载体的结构及改性、微载体技术在临床机体损伤修复中的应用等方面进行综述。
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应用搅拌式生物反应器大量扩增人胎盘间充质干细胞的实验研究
探讨应用搅拌式生物反应器培养技术体外扩增人胎盘间充质干细胞(hPDMCs)的方法.以 hPDMCs为种子细胞,利用微载体悬浮法在搅拌式生物反应器内进行体外培养,同时设置静态培养的培养瓶为对照组,观察细胞的扩增速率、细胞代谢(乳酸、葡萄糖、培养液的pH值)的变化,检测生物反应器培养前、后干细胞的表面标记物.hPDMCs 在搅拌式生物反应器内每代可以扩增 (10.55±1.62) 倍,明显高于对照组 (6.10±0.11) 倍的扩增值(P＜0.05),且细胞生长代谢指标优于对照组;流式细胞仪检测应用搅拌式生物反应器,培养后细胞表面标记物的表达率无明显改变(P>0.05). 搅拌式生物反应器能够提供良好的细胞生长环境,建立用于 hPDMCs 的大量扩增的体外三维培养体系.
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慢性髓性白血病人源树突状细胞的细胞毒作用及其体外扩增
本研究观察来源于慢性髓性白血病患者的CD34+细胞经两步培养扩增后产生的树突状细胞的抗白血病免疫功能.从慢性髓性白血病患者骨髓或外周血中分离出CD34+细胞或外周血单个核细胞分别进行两步培养.首先将其与rhFlt3-L和rhTPO共育7天,再与rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4共同培养14天,以诱导树突状细胞产生;同时以rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4直接诱导体系作对照.获得的DC通过流式细胞仪检测免疫表型,电镜分析细胞超微结构及G显带法进行的染色体分析后,并用MTT法检测DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细胞的杀伤作用.结果表明:慢性髓性白血病的CD34+细胞经过rhFlt3-L和rhTPO的初始扩增培养7天后,CD34+细胞总数扩增77±5倍.用rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4诱导培养14天,DC产率达到(39±8)%,细胞扩增倍数及DC比例均明显高于直接诱导产生的培养方法(P＜0.01),且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖,进而杀伤CML细胞.结论:两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率,优于直接诱导培养;CML细胞来源的DC可诱导产生抗白血病免疫反应.
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不同来源人Vα24+NKT细胞体外扩增及细胞因子分泌
为了研究人脐血(CB)、外周血(PB)及G-CSF动员后外周血采集物单个核细胞(G-PBMNC)中Vα24+NKT细胞的表型及体外扩增、细胞因子分泌情况,分别取来自CB和PB的单个核细胞(MNC)以及G-PBMNC,在含α-半乳糖酰基鞘胺醇(α-GalCer)及细胞因子IL-2、IL-15的体系中,体外扩增培养Vα24+NKT细胞;采用间标磁珠分选纯化NKT细胞;流式细胞术(FCM)检测NKT细胞表型、NKT细胞含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞因子IL4、IFN-γ浓度.结果表明:由CB或PB或G-PBMNC诱导扩增Vα24+NKT细胞可分别扩增221.5倍、456.5倍、756.38倍.CB或PB来源的Vα24+ NKT细胞经PMA刺激后,24小时生成IL4、IFN-γ浓度和IL-4/IFN-γ比率分别为180.33 vs 190.67 ng/ml、864.33 vs 508.49 ng/ml、0.503 vs 0.455.由G-PBMNC诱导扩增Vβ24+NKT细胞,培养9天及12天时生成IL-4、IFN-γ浓度及IL-4/IFN-γ比率分别为139.08 vs 89.3 ng/ml、14264.8 vs 38 14488 ng/ml、0.0531 vs 0.0376.结论:不同来源MNC在α-GalCer、IL-2、IL-15诱导下可以短期有效扩增Vα24+NKT细胞,G-PBMNC诱导扩增的效果优于CB和PB.NKT细胞活化后可以分泌大量IL-4及IFN-γ,但以IFN-γ为主.
关键词： Vα24+NKT细胞 细胞扩增 细胞因子 -
磁力搅拌悬浮培养大规模扩增脐血造血祖细胞
为了利用磁力搅拌悬浮培养装置大规模体外扩增脐血造血祖细胞,从脐血分离单个核细胞,以无血清培养基stemspan添加干细胞因子、FLT-3配基及血小板生成素为培养体系进行培养.先研究磁场(25和50 mT)对静态扩增培养的造血祖细胞生长和集落形成能力的影响,再研究磁力搅拌悬浮大规模培养对造血细胞总数扩增、造血集落形成和表面分子标志表达变化.结果表明,在0,25和50 mT磁场组和磁转子组,细胞总数扩增倍数和造血集落形成数在各组间均无明显区别(p＞0.05).经过7天的扩增培养,磁力搅拌悬浮大规模培养细胞总数扩增倍数为2.8 S0.45,高于静态培养细胞总数扩增倍数(2.1±0.48)(p＜0.01);磁力搅拌悬浮培养组形成的红系集落数(1983.5.±582.6)、粒-巨噬细胞集落数(186.4±62.7)明显高于静态培养形成的相应的造血集落数(分别为1396.2±425.7和136.5±40.8)(p均＜0.05).磁力搅拌悬浮扩增后造血干细胞(CD34+、CD34+/CD38-或CD133+)比例分别为(0.9.±0.34)%、(0.7±0.21)%和(1.1±0.35)%,低于静态培养的干细胞比例[分别为(1.4±0.35)%、(1.2±0.34)%和(1.6±0.68%)](p均＜0.05);但是,归巢相关分子CD184和CD62L高于静态扩增培养.结论:磁力搅拌悬浮装置可能有利于脐血造血祖细胞规模扩增,本研究结果还有待于动物实验及临床移植试验进一步验证.
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人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用
为探讨人参总皂甙(total saponins of panax ginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化.结果显示:10-70μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20μg/ml效果为明显.结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化.
关键词： 人参总皂甙 CD34+造血干/祖细胞 细胞扩增 细胞分化 -
脐血CD34+细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究
本研究探讨人脐血CD34+细胞体外扩增的巨核祖细胞的生物学特性及其免疫原性变化,为体外扩增脐血巨核祖细胞的临床应用提供实验依据.采用Ficoll-Hapaque分离法分离人脐血单个核细胞,应用免疫磁珠法(MACS)再分离富集CD34+细胞,在含血小板生成素(TPO,50 ng/ml)、白介素-11(IL-11,50 ng/ml)和肝素(25 U/ml)的无血清液体培养体系中培养14天.用流式细胞术检测扩增产物免疫表型(CD34+、CD41a+、CD61+、CD34+CD41a+及CD34+CD61+)、巨核细胞凋亡率及其表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达,并进行巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk)的检测.结果显示:脐血CD34+细胞能够有效地向巨核细胞分化,CD41a+和CD61+细胞比例在培养第14天达到峰值,CD34+CD41+和CD34+CD61+细胞比例在扩增第7天达到高峰[分别为(3.41±2.80)%和(1.89±1.43)%];CFU-Mk大集落在扩增第7天达到高峰[(20.66 ±32.79)倍],小集落在扩增第10天达到高峰[(435.62±482.65)倍];在培养7、10和14天时巨核细胞的凋亡率分别为(19.48±9.64)%、(26.87±9.03)%和(52.46±11.74)%,其中培养7天和10天的凋亡率无显著性差异(p＞0.05),培养14天的凋亡率显著高于7天和10天(p均＜0.05);巨核细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达随着扩增天数的延长逐渐降低,其中培养0到10天阶段下降明显.结论:采用TPO+IL 11+肝素组合,可以有效地扩增脐血巨核祖细胞;培养7天,CFU-Mk大集落扩增倍数、CD34+CD41+和CD34+CD61+细胞比例均达高峰,这是巨核祖细胞体外扩增的较佳培养时间.
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骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究
为了探讨胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)中CD133+细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血(CB)中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天.实验分为4组:C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组.在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133+细胞数及集落形成单位(CFU)数.结果表明:各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133+细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组.结论:胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法.
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脐血源MHC限制性杀伤T细胞的扩增及功能研究
目的:本研究通过不同细胞因子的组合定向诱导脐血单个核细胞分化扩增杀伤性T细胞(CTL)并探讨其功能.方法:利用密度梯度离心法获得脐血单个核细胞(MNK),添加IL-2、IL-15、PHA-P和IFN-γ等多种因子,诱导分化并扩增CTL细胞;通过流式细胞术、细胞杀伤实验及定量PCR技术检测其生物学功能.结果:经过15 d的培养细胞数量明显增多,细胞增殖率平均为(1 522±137)％.流式细胞仪检测显示,直接分离的脐血单个核细胞流式分型的结果为95％以上属CD3-CD8-,体外培养15 d后CD3+ CD8+细胞的比例高达82.77±5.61,具有良好的杀瘤活性,直接提取的MNC细胞对HeLa细胞及K562细胞的杀伤效果平均值为(61.88±1.08)％,培养后的CTL细胞杀伤效果均能达到80％以上,平均值为(90.33±2.02)％,与对照组相比有显著提高;同时颗粒酶(Granzyme)A、颗粒酶B、GM-CSF、颗粒溶素(Granulysin)、IFN-γ、TGF-β、TNF-α和穿孔素(perfofin)等相关细胞因子的mRNA表达水平均有不同程度增加,与对照组相比IFN-γ和TGF-β的表达显著上调(P＜0.05),其余因子的表达极显著上调(P＜0.01).结论:脐血造血单个核细胞能体外分化为杀伤性T淋巴细胞,并可以大量扩增,脐血可以作为肿瘤过继免疫治疗所需T淋巴细胞的来源.
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裸鼠腹腔输注体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓CD34+CD59+细胞的研究
应用BALB/c裸鼠为移植模型,将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal noctumal hemoglobinuria,PNH)病人的CD34+CD59+细胞进行移植,研究其增殖能力和重建造血的情况,为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)奠定基础.本研究利用免疫磁珠双阳性分选法,从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34+CD59+细胞进行体外扩增,并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB/c裸鼠.结果显示:移植6周后,用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45+细胞,而接受PNH病人CD34+CD59+细胞移植后的裸鼠,其血常规指标有一定恢复,但并未完全恢复.结论:PNH病人骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性,在照射的裸鼠中能重建造血.
关键词： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 CD34+CD59+细胞 细胞扩增 裸鼠 -
磁珠双阳性分选法在阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增的应用
应用磁珠双阳性分选法在体外扩增阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者的CD34+CD59+细胞,为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)奠定基础.流式细胞术分选虽然经常用于细胞纯化,但难于满足大规模临床细胞分选的需要.本研究利用免疫磁珠系统,应用隔夜孵育法去除第一次分选时CD34+细胞吸附的磁珠,经过两次磁珠双阳性分选,从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34+CD59+细胞,用于体外培养扩增.结果显示:磁珠双阳性法分选的CD34+CD59+细胞与磁珠-流式细胞术二步分选法比较,在细胞生存、增殖、扩增及形成造血集落形成单位(CFU)的能力上均无显著性差异.结论:磁珠双阳性分选法可能推广应用于其它双阳性或多阳性细胞的分离纯化,尤其是造血干/祖细胞的分离纯化.
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PNH患者骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增及植入体内重建造血的活性研究
本研究应用BALB/c裸鼠为移植模型探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobin-uria,PNH)患者CD34+CD59+的增殖和重建造血的能力,为实现PNH患者自体骨髓移植或自体外周血造血干细胞移植提供实验依据.利用免疫磁珠双阳性分选法,从正常人及PNH患者骨髓中分离出两组CD34+CD59+细胞,分别进行体外扩增,并将体外扩增的正常人和PNH患者骨髓CD34+CD59+细胞分别输注给修稿亚致死剂量照射的BALB/c裸鼠.应用流式细胞技术和DNA检测技术检测受鼠骨髓、脾脏和外周血中人CD45+细胞.结果表明:PNH组的CD34+CD59+细胞在体外生存、扩增能力似弱于正常人对照组.但CD34+CD59+细胞输注给受鼠后6周,在受鼠骨髓、脾脏和外周血中可检测到人CD45+细胞,PNH组受鼠CD45+细胞水平与正常人对照组相比,无统计学差异.结论:PNH患者CD34+CD59+细胞仍具有同正常人CD34+CD59+细胞相同的生物特性,能体外扩增并能保持正常干/祖细胞的特性.
关键词： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 CD34+CD59+细胞 细胞扩增 -
miR-1与肿瘤
MicroRNAs (miRNAs)是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小RNA分子,它们由相应的基因编码,转录后通过一系列加工过程,形成成熟的miRNA分子.成熟的miRNA通过与靶mRNA的3'非编码区(3UTR)结合,抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性,从而调节基因表达,在个体发育、细胞增殖、凋亡和肿瘤发生等过程中发挥了重要的调控作用[1].据估计,30％的人类基因受到miRNAs调控,这也表明miRNAs可能影响所有的信号途径[2].其中,miR-1存在于大多数动物种系,特异性表达于心肌和骨骼肌细胞,通过作用于组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)而促进成肌细胞分化,抑制细胞扩增,近年来研究发现其与肿瘤发生发展也密切相关,本文将就上述问题进行系统阐述.
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口袋蛋白家族在胰岛发育及稳态调控中的研究进展
糖尿病是危害社会发展的重大健康问题之一。虽然病因复杂，但胰岛在血糖稳态调节中的核心作用毋庸置疑。恢复胰岛β细胞的功能和数量一直是临床治疗糖尿病的关键。细胞周期分析显示，胰岛β细胞增殖十分缓慢，绝大多数（97%～99%）处于G0/1期[1-3]。阻止β细胞通过G1/S期周期转换的分子机制尚不清楚。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）是调控G1/S期细胞周期转换的重要分子，与视网膜母细胞瘤样蛋白1（p107）、视网膜母细胞瘤样蛋白2（p130）具有相似的口袋状DNA结合区域，共同属于口袋蛋白家族[3-5]。有关口袋蛋白家族的研究主要集中在肿瘤领域。近年研究显示，2型糖尿病患者胰岛Rb基因表达显著降低[6]，其在胰岛细胞扩增中的作用正日益受到重视。本文就口袋蛋白家族在胰岛发育及稳态调控中的研究进展作一综述。
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成肌细胞在肌肉骨骼系统疾病基因治疗中的应用研究进展
基因治疗,就是利用分子生物学的方法将目的基因转入靶细胞内,通过靶细胞表达目的基因产物治疗疾病的方法.基因治疗主要有两种途径:即in vivo 及ex vivo 方式.in vivo 途径即体内基因治疗,是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体,直接导入体内.ex vivo 途径也称"回体基因治疗",是将含有外源基因的载体在体外导入自体或异体(异种)细胞,经体外细胞扩增后,输回自体.此方法易于操作,并且使用自体细胞有利于解决安全性问题.
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基因调控表达技术的建立及在多潜能造血干/祖细胞扩增调控中的应用
干细胞是一种原始多潜能的细胞,具有自我更新和定向分化的基本特征.为了克服干细胞数量少的不足,众多学者已经在积极探索干细胞的扩增方法.目前国内外采用不同细胞因子的组合方案来进行干细胞的扩增,但其扩增的结果存在很多问题,主要体现在:扩增的时间短,倍数低,扩增体系难于调控,扩增后的干细胞自我更新能力,可塑性及造血重建的功能均较扩增前下降.
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大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究
目的 研究体外大鼠骨髓间充质干细胞的生长特性.方法 在无菌条件下,取大鼠骨髓,采用密度离心法和全骨髓贴壁法联合培养并结合传代获取、纯化细胞,倒置显微镜观察其形态,流式细胞术检测其表面抗原CD29、CD90 及CD34的表达.CCK-8 法测定第1、3 代细胞的增殖情况,并绘制其生长曲线.结果 经全骨髓贴壁法和密度梯度离心联合培养,所得到的原代细胞形态呈椭圆形、圆形、三角形,接近融合状态时可呈现均一的长梭形,排列规则.传至第8 代时,细胞的增殖能力减弱,其形态宽大畸形,呈树枝状.经流式细胞仪检测,所分离的细胞CD29 的表达率为94.97%,CD90的表达率为88.50%,CD34 的表达率为2.23%.CCK-8 法显示第3 代细胞有较强的增殖能力.结论 体外培养的大鼠BMSCs 是骨组织工程的优良种子细胞.
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干细胞因子与FLT3配基协同促巨核细胞生成因子对脐血单个核细胞的扩增及造血重建功能的影响
脐血移植后常常伴随着造血延迟和感染等危险因素的增加[1].而细胞因子介导的体外扩增有望能解决这一问题,但体外扩增时要想能达到有效的扩增脐血造血细胞,又能使扩增后的脐血造血细胞维持或增加植入潜能,和扩增培养起始细胞的选择及细胞因子的组合密切相关.本实验探讨了不同细胞因子组合对脐血单个核细胞扩增的效果并利用非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic-severe combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠评估扩增后的脐血细胞的植入和造血重建功能.
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Th1/Th2细胞失衡对重型再生障碍性贫血CD34+细胞的免疫抑制效应
再生障碍性贫血(再障)的发病与T细胞介导的造血抑制有密切联系[1,2].我们曾发现,重型再障患者骨髓的Th1样细胞因子干扰素(IFN)γ水平明显上调,而Th2样因子IL-4却大致正常,间接提示重型再障可能存在Th1/Th2细胞比例失衡[3].为探讨Th1/Th2细胞失衡对骨髓造血功能的效应,们利用CD34+细胞和Th细胞的混合培养体系,在体外模拟Th1/Th2细胞的交互调节过程,观察了对CD34+细胞扩增和集落形成的影响.
