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乳腺癌肿瘤干细胞体外培养体系的建立
目的 建立一种适合乳腺癌肿瘤干细胞体外培养的三维培养体系.方法 根据不同的培养方法分为两组:二维细胞培养组,采用传统二维细胞培养方法培养乳腺癌MCF-7细胞;三维细胞培养组,将乳腺癌MCF-7细胞接种于三维胶原支架材料上,在摇床上动态培养5d,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察乳腺癌肿瘤细胞在胶原材料上的形态学特征.采用CCK-8细胞增殖检测的方法,比较三维培养组和二维培养组细胞增殖能力,通过流式细胞术检测两组乳腺癌肿瘤干细胞标志CD44+/CD24-/low的表达差异.结果 光学显微镜下观察结果显示:二维培养组MCF-7细胞为单层生长平展的粘附生长,呈多边形、铺路石样的上皮细胞形态;三维培养组MCF-7来源的细胞再次二维培养后,细胞展现出三角形或者长梭形及较多细胞呈不规则形,部分细胞还伸展出长浸润性伪足.激光共聚焦显微镜观察显示,MCF-7细胞均匀地生长在三维支架材料上,局部放大后清晰可见长伪足,且细胞大小不均一,细胞形态多样.三维培养组细胞增殖速度与二维培养组相似.与二维培养组相比较,三维培养组CD44+/CD24细胞比例显著增加,由38.9％增加至60.3％.结论 基于三维胶原支架材料的三维培养体系能够有效维持乳腺癌肿瘤干细胞干性.
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水蛭素抑制体外模拟增生陛瘢痕模型的实验研究
目的:研究水蛭素对体外人增生性瘢痕模型的收缩能力,成纤维细胞的增殖、胶原分泌等功能的影响.方法:体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB),建立含增生性瘢痕成纤维细胞的胶原网架系统(FPCL),用1、10、50U/ml的水蛭素溶液干预该模型,测定凝胶块收缩指数,利用MTT染色计数活细胞,逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达.结果:浓度为10U/ml和50U/ml水蛭素溶液能够抑制HSFB的活力,使FPCL收缩指数降低,抑制FPCL中HSFB Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达(P<0.05).结论:水蛭素溶液可抑制体外人增生性瘢痕三维模型的收缩功能和成纤维细胞增殖、分泌胶原功能.
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人博卡病毒Ⅰ型的研究进展
人博卡病毒1型(HBoV1)为引发呼吸道感染一种新发病毒,具有典型的细小病毒科病毒基因组特征,3个开放阅读框分别编码非结构蛋白NS1、NP1和结构蛋白VP1和VP2;HBoV1进行滚环复制时存在复制环形附加体,附加体的发现为扩增HBoV1全基因组和构建感染性克隆拯救病毒提供可能,同时HBoV1与HBoV2-4间存在着重组关系;HBoV1的体外增殖随着三维立体细胞培养而成为现实,为HBoV1的致病机制研究提供有力平台.本文重点对HBoV1的分子生物学特征、疾病相关性、体外增殖培养、HBoV1的诊断和治疗进行阐述.
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胚胎干细胞与聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯共培养细胞补片的初步研究
目的 干细胞移植是具有治疗心血管疾病潜力的有效方法,但是细胞移植过程中缺乏有效的载体会大大影响其成活和增殖.聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯P(3HB-co-4HB)是一种能够完全降解的,具有良好物理特性的高分子材料.探讨P(3HB-co-4HB)这种三维材料是否适合胚胎干细胞在上面生长,并生成细胞补片.方法 复苏小鼠胚胎干细胞,传代培养,消化离心后重悬细胞,用悬滴法形成拟胚体(embryid bodies,EB),将拟胚体与P(3HB-co-4HB)膜共培养;72 h共培养后固定并进行扫描电镜和共聚焦显微镜观察细胞黏附情况,DAPI荧光染色观察细胞在P(3HB-co-4HB)膜上形态.结果 胚胎干细胞在培养皿中贴壁生长良好,形态正常;拟胚体同P(3HB-co-4HB)膜共培养72 h后,所有拟胚体都在三维材料表面良好生长,爬膜率为100％;Confocal显微镜和扫描电镜观察到在2 mm的三维膜上,拟胚体生长贴附在生物膜上,细胞形态正常.结论 ESC在P(3HB-co-4HB)表面生长、增殖形成细胞补片.P(3HB-co-4HB)可作为干细胞治疗多种疾病的支架材料之一.
关键词： 胚胎干细胞 细胞补片 聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯 三维培养 -
基于水凝胶的内皮细胞三维培养
目的 研究可注射温度敏感性水凝胶的生物相容性,探讨其做为三维培养材料的可行性.方法 将人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞接种于水凝胶,体外共同培养后进行形态结构观察,用MTT法检测ECV304细胞增殖活性,AO/EB试剂盒观察细胞凋亡,NO试剂盒测量细胞分泌NO等功能.结果 ECV304细胞在水凝胶中生长及功能均比较理想.AO/EB双重染色有少量黄色荧光,显示仅有少量细胞凋亡.细胞在水凝胶中培养后上清液体中分泌的NO浓度与二维培养组之间差异显著性无统计学意义(P=0.948). 结论 可注射温度敏感性水凝胶生物相容性好,是一种良好的三维培养材料,可作为种子细胞的载体应用于组织工程中.
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miR-184在碱烧伤大鼠角膜新生血管中的表达及靶基因预测分析
目的 初步探miR-184在碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管形成过程中的作用和基因调控机制.方法 碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管形成.基质胶上建立人脐静脉血管内皮细胞体外三维培养体系.应用qRT-PCR检测miR-184的体内外表达.生物信息学方法预测并分析miR-184靶基因.结果 初步建立起血管新生的体内外研究模型,miR-184在碱烧伤大鼠角膜新生血管角膜中的表达(0.145±0.013)较正常角膜(1.015±0.189)显著下降(P＜0.01),而在人脐静脉血管内皮细胞中相对表达量极少(0.007±0.004) (P ＜0.05).预测的靶基因与VEGF血管生成信号通路有关.结论 新生血管进程中伴随着miR-184表达量降低,提示其与血管新生密切相关,可能通过VEGF信号通路参与碱烧伤角膜新生血管形成.
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体外三维培养骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞及其极化特征
目的 探讨体外三维诱导培养体系下人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化及极化特征.方法 从成人骨髓中分离出骨髓间充质干细胞(BMSC),利用胶原蛋白三维培养体系进行体外诱导培养.用HE染色法观察分化肝细胞的形态及结构特征,用免疫组化法检测肝细胞特异性蛋白的表达,用免疫荧光法检测极化蛋白BSEP和SRBI的表达特征.结果 成人BMSC在体外胶原蛋白三维诱导培养体系中呈多层排列生长,形成细胞间紧密连接及管状结构.BMSC分化来源肝细胞特异性表达ALB及AFP.肝细胞极化蛋白BSEP和SRBI在肝细胞呈特征性分布.结论 BMSC在体外胶原三维培养体系中可诱导分化为肝细胞,并形成肝组织特征性的极化结构.
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多细胞球样体的制备及其在肿瘤治疗研究中的应用
多细胞球样体(MCS)模型具有与体内细胞相似的生理或病理特性,能够更好地模拟细胞在体内的生物学行为,被广泛应用于治疗效能检测中,包括放疗、化疗、免疫治疗、联合治疗等;基于MCS建立的共培养系统为研究同种或异种细胞间的关系提供了良好的平台.本文将对多细胞球样体的制备及应用尤其是近年的新进展做一简要综述.
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体外构建胚胎干细胞生长分化的三维培养模型
目的 以液态胶原为支架,小鼠胚胎干细胞(ESCs)为细胞模型,构建ESCs-胶原复合体,旨在尝试建立一种能够实现干细胞生长、分化的三维培养体系.方法 提取鼠尾胶原,观察ESCs在自制胶原条带内增殖的形态特征,并测定葡萄糖/乳酸活性.以ESCs源心肌细胞为目的细胞,利用免疫组化、RT-PCR及电镜技术评价胶原条带内ESCs进行自发性分化的能力.结果 ESCs在胶原条带所提供的三维培养体系内生长、增殖状态良好,且彼此间能够建立细胞连接.胶原条带内部分ESCs能够自发性分化为心肌细胞.该心肌细胞均可表达心肌蛋白cTn-T,心肌转录因子NKX2.5及肌球蛋白轻链MLC-2v mRNA,且肌小节结构发育成熟.结论 以液态I型胶原为主体的支架材料可以为ESCs提供良好的生长基质,促进其组织化发育.该实验初步明确了体外构建干细胞生长分化三维模型的可行性.
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人脐血造血干细胞体外扩增方法初探
目的 建立人造血干细胞(HSC)体外大量扩增的佳培养模型.方法 采用模拟骨髓微环境的成骨细胞共培养法、条件培养基及模拟微重力效应三维培养等方法进行人脐带血来源HSC体外扩增.结果 在用含15%的条件培养基与成骨细胞共培养条件下,HSC的扩增倍数高,第7天和第14天扩增倍数分别为6.46和14.82倍.在此条件下进行集落形成实验对扩增后造血干细胞多能性的功能检测发现,粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及红系集落形成单位(BFU-E)数目也多.结论 以成骨细胞作为饲养层细胞,添加15%的条件培养基不仅能使HSC在体外大量增殖,并且具有维持HSC自我更新和多向分化潜能.
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主动脉平滑肌细胞在三维培养中产生弹性纤维的研究
目的研究主动脉平滑肌细胞(ASMC)在仿真皮替代物的三维培养中是否能产生弹性纤维. 方法取1周龄SD大鼠胸主动脉,进行原代和传代培养,以α肌动蛋白免疫细胞化学染色鉴定平滑肌细胞.然后,将ASMC与胶原、甲壳素及糖胺多糖组合形成的凝胶混合,进行三维培养;培养1周和2周后,用Gomori醛复红染色和弹性蛋白免疫细胞化学染色,检测ASMC胶原凝胶. 结果传代细胞经α肌动蛋白免疫细胞化学染色鉴定,98%以上为ASMC.培养1周和2周的ASMC胶原凝胶中,均显示有弹性纤维存在. 结论 ASMC在仿真皮替代物的三维培养中能够产生弹性蛋白,并形成弹性纤维.
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Atelocoilagen胶原支架在三维培养大鼠心肌中的生物相容性
目的 探讨atelocollagen胶原支架在三维培养心肌细胞中的生物相容性,寻找三维培养心肌组织的条件和理想的支架材料.方法 原代培养的大鼠心肌细胞经纯化后,将细胞悬液接种到胶原纤维支架上,动态观察第8d、16d、20d在atellcollagen胶原纤维支架上生长的细胞的变化,并进行光镜、扫描电镜和透射电镜观察.结果 接种后第1d形成细胞.胶原支架搏动复合体,细胞与支架一起有节律的跳动;心肌细胞填充于支架网孔周围.并与支架融合;在透射电镜下,3个时间段均发现细胞与支架紧密相贴,融合在一起;在扫描电镜下发现,细胞在胶原纤维支架上贴附并充分伸展.相互融合成片.结论 atelocollagen胶原支架的生物相容性较好,可作为三维培养细胞和组织的天然材料,适于心肌组织的立体培养.
关键词： 心肌细胞 三维培养 生物相容性 atelocollagen胶原支架 大鼠 -
模拟微重力对许旺细胞三维培养影响的初步研究
目的初步探讨模拟微重力对许旺细胞三维培养的影响.方法分别把粘附在聚羟基乙酸支架上生长3、7、10及14天的许旺细胞和新鲜分离的原代许旺细胞悬液连同聚羟基乙酸支架送入转壁式生物反应器(RWVB)中旋转培养5天,观察细胞在支架上的生长情况及超微结构的改变.结果粘附在支架上的许旺细胞进入模拟微重力环境后细胞变圆变小,核染色质聚集,细胞器水肿扩张,核/浆比例明显增大,微丝微管松散紊乱,细胞在3天内快速凋亡或碎裂溶解;尚未贴壁的原代许旺细胞进入模拟微重力环境后在支架表面均匀贴壁生长、增殖,蛋白合成活跃,个别细胞内可见髓鞘样结构,5天内未见细胞死亡现象.结论贴壁生长3～14天的许旺细胞进入模拟微重力环境后表现为快速凋亡、溶解,而未贴壁的原代许旺细胞进入模拟微重力环境后则功能活跃表达及快速增殖,可用于构建比较理想的许旺细胞三维培养体系.
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应用三维胶原复合支架培养U251细胞构建体外胶质瘤模型
目的 探讨恶性胶质瘤细胞在二维和三维培养条件下的生物学行为差异,体外构建三维胶质瘤模型体系.方法 以人胶质母细胞瘤细胞U251及U251-GFP作为模型细胞,于制备的三维胶原复合支架内培养,以二维贴壁培养的肿瘤细胞为对照,利用光学显微镜、电子显微镜和荧光显微镜观察细胞形态及生长特征;采用细胞活性与周期测定比较不同培养模型的细胞增殖和周期差异;采用苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化等方法研究三维细胞培养条件下肿瘤细胞的部分特征蛋白表达.结果 胶质瘤细胞在三维胶原复合支架中培养后在支架内黏附、浸润生长,并聚集成不规则团块状,细胞形态多样,而二维培养的细胞以单一的梭形为主.培养12 d,三维培养的胶质瘤细胞增殖速度显著慢于二维贴壁培养的细胞,差异有统计学意义(P<0.05).在三维模型中胶质瘤细胞的G0/G1期比例由65.52%增加至81.01%,而S期和G2/M期比例则分别由25.59%、8.89%减少至15.96%、3.03%.进一步的免疫组化显示三维胶质瘤细胞培养模型中,神经胶质细胞标志物GFAP阳性表达,而神经元标志物Neun阴性表达,其增殖指数也与临床常见肿瘤标本接近.结论 三维培养胶质瘤细胞在形态学、增殖速度、细胞周期等方面与二维培养细胞差异明显,并且具有类似体内高级别胶质瘤的免疫组化特点,三维胶原复合支架能更好地模拟体内胶质瘤生长的微环境,可作为胶质瘤体外模型用于多种研究.
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脉动式张应力环境下培养组织工程血管的初步实验
目的 探讨脉动式张应力环境下,在生物反应器内进行组织工程血管(TEBV)培养的可行性.方法 从人脐动脉获取血管平滑肌细胞(VSMC),经体外培养扩增后接种到聚乙醇酸(PGA)支架并置于生物反应器内进行三维培养.实验组利用气动式左心循环辅助泵对VSMC施加模拟人体内血管环境(压力120 mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa,频率60次/min)的脉动式张应力作用.对照组无张力环境下进行三维培养.2周后收获TEBV分别行扫描电镜(SEM)检测、组织切片HE染色和Masson染色.结果 实验组TEBV外观色泽鲜亮,具有一定厚度和弹性,能自我维持管腔形状.SEM显示实验组TEBV管壁表面光滑平整,横切面有丰富的细胞外基质(ECM),ECM分布均匀,把PGA完全包裹.HE染色管壁均匀致密,ECM及细胞的排列具有一定方向性,其中含有未降解的PGA碎片.Masson染色管壁胶原纤维丰富.对照组TEBV外观色泽暗淡,管壁薄,弹性差,从支架取下后管腔塌陷.SEM显示管壁表面欠光滑,横切面上ECM含量少,大部分PGA没有被包裹.组织切片染色管壁结构疏松,ECM和胶原纤维含量较少,层次感差.结论 在生物反应器内的脉动式张应力环境下,可培养出具有良好形态结构的组织工程血管样组织.
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ECM支架构建肺成纤维细胞三维培养模型研究
应用组织工程技术建立新型稳定、可靠的肺成纤维细胞(LF)三维培养模型的方法.应用细胞外基质(ECM)支架为成纤维细胞培养载体,建立成纤维细胞三维培养体系;并同时分别加入IL-13单克隆抗体、TGF-β及LPS.应用细胞荧光免疫、细胞计数及扫描电镜观察肺成纤维细胞三维培养的生长特性及相关物质对细胞生长状况的影响.在此三维培养模型中,细胞、细胞外基质以及IL-13单克隆抗体、TGF-β等调控因素共同构成一个有机整体,成纤维细胞所表达的生物学特性接近于它们在体内肺组织中的特点.本实验应用组织工程技术成功地建立了新型肺成纤维细胞三维培养体系,并研究成纤维细胞的生物学特性,是研究间质性肺病(ILD)领域里一个新的和更为科学的方法.
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三维培养对脐带间充质干细胞表型及造血因子基因表达的影响
本研究探讨三维立体培养条件下脐带间充质干细胞(UC-MSC)的细胞表型变化及部分造血相关因子的基因表达,为下一步研究三维立体条件下的造血扩增及诱导分化提供基础.从脐带中分离出MSC,分别在二维及三维条件下培养,通过流式细胞术检测MSC表面抗原的表达水平,通过成血管试验比较了两种细胞的成血管能力,并通过实时定量PCR检测两种培养条件下造血相关细胞因子的基因表达情况.结果表明:从脐带中成功地分离出了MSC,在三维培养条件下其内皮细胞、内皮祖细胞和间充质原始干细胞的表面标记CD31、CD133和CD271等阳性细胞百分比显著增加,体外成血管能力增强;骨架蛋白β-actin基因在三维培养条件下表达上调,G-CSF、LIF、SCF、IL-1 α、IL-1β、IL-3、IL-7和IL-11等与造血调控有关的细胞因子基因表达也有不同程度的增高,其中LIF、IL-3和IL-7升高尤为明显;免疫调控相关的细胞因子IL-10的表达也增高,而SDF-1和IL-6的表达虽有轻微的降低,但无显著性差异.结论:三维培养条件下UC-MSC的CD31、CD133和CD271表达上调,体外成血管能力增强,并且多个造血相关因子的基因表达水平上调.
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超声辐照载诺帝脂质微泡对血管内皮细胞增殖的影响及体外内皮细胞三维成型的抑制作用研究
目的 探讨超声辐照载诺帝脂质微泡对正常血管内皮细胞增殖的影响及体外内皮细胞三维成型的抑制作用研究.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并且进行内皮细胞体外三维培养.将细胞分5组,即对照组,载诺帝微泡组,诺帝溶液组,超声辐照诺帝溶液组,超声辐照载诺帝脂质微泡组.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察不同处理组对细胞生长的影响.比较不同处理组对内皮细胞三维培养的影响.结果 在诺帝浓度为200 μmol/L时,超声辐照载诺帝微泡组对细胞增殖抑制作用强于其他处理组及对照组；在三维培养3、5、7、9d后观察发现,超声辐照载诺帝微泡组对体外管腔形成的抑制作用更显著,差异有统计学意义.结论 超声辐照载诺帝脂质微泡造影剂对人脐静脉内皮细胞的生长和体外管腔形成有明显抑制作用.
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巨噬细胞对血管紧张素Ⅱ作用下三维共培养体系中心脏成纤维细胞转分化的影响
目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)作用下,细胞三维共培养体系中巨噬细胞对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)表型转化的影响.为观察细胞之间的相互作用,探讨高血压导致心脏纤维化的分子机制及防治策略提供了新思路.方法:分离、培养原代小鼠骨髓巨噬细胞及乳鼠CFs,建立巨噬细胞和CFs多肽纳米凝胶三维共培养体系.实验分为CFs组,巨噬细胞与CFs共培养组,CFs+AngⅡ处理组,巨噬细胞与CFs共培养+AngⅡ处理组.通过免疫荧光染色鉴定培养的巨噬细胞(巨噬细胞标志物F4/80)及成纤维细胞(波形蛋白Vimentin)；采用倒置相差显微镜观察三维培养细胞形态；免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达；实时定量PCR检测α-SMA、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)及促纤维化因子[转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)]的表达.结果:在无AngⅡ作用下,巨噬细胞与CFs共培养组与单独培养的CFs组比较,α-SMA mRNA和蛋白表达,并且Collagen Ⅰ、TGF-β3和CTGF mRNA的水平差异无统计学意义.巨噬细胞与CFs共培养组经AngⅡ处理后,可明显诱导α-SMA mRNA和蛋白高表达,并且上调Collagen Ⅰ、TGF-β3和CTGF mRNA的水平.结论:在AngⅡ作用下,三维培养体系中巨噬细胞可促进CFs向肌成纤维细胞表型转化,提示巨噬细胞在AngⅡ导致心脏纤维化的病理过程中发挥关键作用.
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转壁反应器三维立体培养多样本骨髓间充质干细胞实验研究
目的 探讨微载体三维立体培养自体骨髓间充质干细胞(MSC)方法.方法 制备明胶多孔微载体,反应器内培养多样本自体MSC,比较其与普通培养的差异,研究生长曲线、粘附曲线、活力变化、糖消耗情况、蛋白合成以及碱性成纤维细胞生长因子影响.结果 相转化法制备直径180～300um/孔径40～70um微载体.在合适的培养参数下,三维培养显著优于普通培养,细胞增殖迅速,糖消耗较快,蛋白产量无显著差异,碱性成纤维细胞生长因子可抑制三维培养的细胞传代老化.结论 相转化法可有效制备多孔微载体,微载体三维立体培养自体MSC是获取组织工程种子细胞的有效方案.
