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hTGF-β1基因修饰BMSCs复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化软骨
目的 探讨hTGF-β1转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化软骨的可行性. 方法 全骨髓法获取和培养大鼠BMSCs,取第3代细胞接种于细胞培养板.实验分成3组:Ad-hTGF-β1转染组、Ad-EGFP转染组、空白对照组,前两组分别加入含Ad-hTGF-β1与Ad-EGFP的无血清培养基,空白对照组添加不做任何处理的完全培养基.7d后,运用实时荧光定量PCR与Western blot检测TGF-β1的表达情况.将Ad-hTGF-β1成功转染组的BMSCs继续大量扩增后.按照1.0×107/ml的细胞密度制成细胞—藻酸钙凝胶复合物,将复合物置于培养箱中继续体外培养.10d后,观察凝胶材料中的细胞形态与增殖情况,并将复合物包埋、切片,进行组织学及免疫组织化学染色分析软骨分化情况. 结果 转染后7d,实时荧光定量PCR结果显示TGF-β1表达量的平均相对比值Ad-hTGF-β1转染组(0.863)明显高于Ad-EGFP转染组(0.183)、空白对照组(0.180),差异有统计学意义(P＜0.05).Westem blot检测发现Ad-hTGF-β1转染组的细胞内TGF-β1表达呈强阳性,而Ad-EGFP转染组及空白对照组细胞内的TGF-β1表达很弱.倒置显微镜观察到细胞在藻酸钙凝胶中能够很好的维持球形生长；MTr检测显示,不同时间点细胞在藻酸钙凝胶中的数量变化差异无统计学意义(P＞0.05).HE染色可见有大量软骨陷窝形成,甲苯胺蓝、Masson染色可见有软骨基质分泌,CollagenⅡ免疫组织化学染色呈阳性表达. 结论 hTGF-β1成功转染的BMSCs,在藻酸钙凝胶材料中培养在维持细胞形态的同时能够很好的向软骨细胞分化,此种培养方法更能模拟细胞在体内的生长方式.
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许旺细胞在支架材料中的三维生长与迁移的研究
目的研究许旺细胞在聚乳酸(PLA)无纺纤维布及聚羟基乙酸(PLGA)纤维丝上的粘附、三维生长及迁移情况.方法将许旺细胞/ECM凝胶悬液与PLA无纺纤维布及经胶原、多聚赖氨酸和ECM预处理的PLGA纤维丝复合培养,相差和激光扫描共聚焦显微镜观察许旺细胞在纤维丝中的三维生长和迁移.结果许旺细胞/ECM悬液,与PLA无纺纤维布复合,随着凝胶的形成,大部份许旺细胞滞留在纤维网孔中,多数细胞和纤维丝贴附,形成多层排列的类似Btingner带状的许旺细胞柱.许旺细胞能贴附在PLGA纤维丝上生长并沿纤维丝移行,ECM凝胶能显著增加贴附和移行细胞数量.结论ECM凝胶能促进许旺细胞在支架中的黏附、生长与迁移,是构建组织工程化人工神经的良好整合材料.
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运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系
目的探讨普通重力和模拟微重力条件下构建许旺细胞三维培养体系的方法。方法对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修饰；分别在普通重力和模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上，观察许旺细胞的粘附生长情况。结果两种重力条件下许旺细胞在聚羟基乙酸支架表面都能良好贴壁生长，培养2 d时细胞生长稳定、密度适中；模拟微重力条件下许旺细胞在支架表面的分布更均匀。结论普通重力和模拟微重力环境都适宜构建许旺细胞的三维培养体系，模拟微重力环境可能更为有利。
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三维培养药敏实验测定的胃癌药物敏感性与多药耐药基因蛋白表达的关系
背景与目的:目前胃癌化疗疗效尚不理想,通过预测个体肿瘤对药物的敏感性来指导临床治疗,以提高疗效,早已成为化疗界瞩目的问题.本研究通过三维培养药敏实验测定胃癌的药物敏感性,并通过测定多药耐药基因表达产物水平,分析两者之间的关系.方法:应用三维培养体外药敏实验技术,测定表阿霉素、顺铂、草酸铂、5-FU、泰素帝、伊立替康6种单药和5-FU+表阿霉素+顺铂、5-FU+伊立替康、5-FU+草酸铂、5-FU+泰素帝+顺铂4组联合用药对22例胃癌组织的抑制率,并计算敏感率;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法检测胃癌组织中 MDR1、MRP1、ABCG2基因蛋白的表达.结果:单药组中5-FU对胃癌组织的抑制率和敏感率高,分别为29.8%和50.0%联合用药组抑制率高为5-FU+泰素帝+顺铂(59.8%),敏感率高为5-FU+表阿霉素+顺铂(77.3%);联合用药组抑制率和敏感率均高于单药组(P<0.05).胃癌组织中MDR1、MRP1、ABCG2 mRNA的阳性率分别为90.9%、54.5%、77.3%,MDR1、MRP1、ABCG2蛋白的阳性率分别为36.4%、54.5%、36.4%;多药耐药蛋白高表达与胃癌对表阿霉素的耐药有相关性(P<0.05).结论:胃癌组织中多药耐药基因MDR1、MRP1、ABCG2蛋白高表达与胃癌组织对表阿霉素的耐药有关,提示这三种耐药基因可能参与介导表阿霉素的耐药.
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肝细胞癌中血管生成拟态的三维细胞培养及组织学研究
背景与目的:血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是新近发现的一种存在于恶性肿瘤中的血液供应方式.拟态血管由肿瘤细胞围成,无内皮细胞衬覆的管道样结构,其间有血液通过.目前对拟态血管的研究多局限在高侵袭性、双向分化的恶性肿瘤,对上皮来源的肿瘤很少涉及.本研究通过细胞三维培养,免疫组织化学方法观察肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中是否存在血管生成拟态,并探讨其形成过程及结构特点.方法:建立肝癌细胞株HepG2的三维培养模型,并收集15例肝癌石蜡包埋样本进行过碘酸雪夫氏(PAS)及CD31免疫组织化学双重染色以及PAS与Ferritin免疫组织化学双重染色,观察肝细胞肝癌中的血管生成拟态.结果:肝癌细胞三维培养两天时伸出细长突起,培养7天时彼此之间相互连接形成网络样、环状结构.15例肝癌免疫组织化学染色可见血管内皮CD31染色均为阳性,肝癌细胞Ferritin染色均为阳性.其中7例免疫组织化学与组织化学双重染色可见CD31阴性Ferritin阳性的肝癌细胞围成管道样结构,一层PAS阳性物质将肿瘤细胞同管腔分隔,肿瘤细胞构成的管腔中可见红细胞存在.并观察到分化良好的肝癌中血管生成拟态的形成少于分化差的肝癌,随着分化程度的降低肝癌细胞逐渐出现CD31着色阳性倾向.结论:肝癌细胞具有进行自身变形并与胶原蛋白相互作用,形成血管样通道的能力.肿瘤细胞可以通过血管生成拟态结构获得血液供应.
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鼻咽癌变不同时期的体外三维培养模型建立的实验研究
背景与目的:三维培养更能模拟体内细胞的微环境,细胞的生物学特性比二维培养更接近于活体组织.本研究建立能反映鼻咽癌变过程中不同时期的鼻咽上皮细胞三维培养模型,为进一步研究鼻咽癌的发病机制提供模型.方法:非癌鼻咽活检标本体外培养用于建立鼻咽正常细胞;早期和晚期传代的正常细胞NPNE2、永生化的鼻咽上皮细胞NP69SV40T、鼻咽癌细胞SUNE-1及其高转移潜能亚株5-8F在Matrigel中培养,建立三维培养模型.结果:从非癌鼻咽活检标本长出具有上皮细胞形态特征的细胞,细胞出现衰老前,在体外能够增殖8～10代,角蛋白免疫组化证实其为上皮起源.除晚期传代的NPNE2外,所有细胞均能在三维体系中增殖,NPNE2及NP69SV40细胞主要形成网状结构,克隆形成数少,边沿清楚而光滑,并且细胞间连接紧密;SUNE-1和5-8F形成大而形态不规则的克隆,细胞间连接松散并且克隆边沿不规则,此外,5-8F尚形成大量的伪足,但不形成网状结构;而晚期传代的NPNE2增殖能力低,无法形成细胞网状结构,也不形成细胞克隆.结论:从非癌鼻咽活检标本成功培养出正常鼻咽上皮细胞,采用正常细胞、永生化鼻咽上皮细胞及肿瘤细胞建立了可能反映体内鼻咽癌发生、发展不同时期的三维培养模型.
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三维培养药敏实验测定的结直肠癌化疗敏感性与多药耐药基因蛋白表达的关系
背景与目的:目前肿瘤化疗疗效尚不理想,通过预测个体肿瘤对化疗药物的敏感性来指导临床治疗,有可能提高化疗疗效.本研究通过三维培养药敏实验测定结直肠癌的药物敏感性,并分析与肿瘤组织多药耐药基因表达产物水平的关系.方法:应用三维培养体外药敏实验技术.检测表阿霉素、顺铂、草酸铂、氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、泰素帝、伊立替康6种单药和5-FU+表阿霉素+顺铂、5-FU+伊立替康、5-FU+草酸铂、5-FU+泰素帝+顺铂4组联合用药对22例结直肠癌组织的抑制率,抑制率大于30%定义为敏感,计算敏感率.应用逆转录聚合酶链反应和免疫组化法测定结直肠癌组织中MDR1、MRP1、ABCG2基因蛋白表达水平;用Spearman相关分析法分析肿瘤药物敏感性和多药耐药蛋白表达的相关性.结果:单药组抑制率高为草酸铂(17.5%),敏感率高为5-FU(36.4%);联合用药组抑制率高为5-FU+草酸铂(54.1%),敏感率高为5-Fu+表阿霉素+顺铂(71.4%)和5-FU+泰素帝+顺铂(71.4%);联合用药组抑制率和敏感率均高于单药组(P<0.05).MDR1、MRP1、ABCG2 mRNA的阳性率分别为88.9%、55.6%、55.6%;MDR1、MRP1、ABCG2蛋白的阳性率分别为55.6%、33.3%、50.O%;多药耐药基因MDR1、MRP1、ABCG2 mRNA和蛋白的表达无相关性(P>0.05).ABCG2蛋白高表达与结直肠癌对表阿霉素的耐药有相关性(P<0.05).结论:结直肠癌多药耐药蛋白表达与肿瘤药物敏感性有一定相关性:结合三维培养药敏实验和多药耐药基因表达产物水平检测,有可能对个体肿瘤的化疗敏感性进行预测,筛选化疗敏感药物.
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Notch1通路与胶质瘤细胞管道形成能力相关性研究
目的 探索胶质瘤细胞来源的管道(glioma clls derived vessels,GCDV)的形成机制.方法 将胶质瘤细胞株U87、U251、U373、SF295、T98G、SKMG-4和C6进行体外三维培养,观察其管道形成能力.Western blot检测各个胶质瘤细胞株Notch1、Dll4蛋白的表达情况.结果 三维培养C6细胞单个视野下(100×)的平均管道数(25.2±5.0)个,U373为(36.4±3.20)个,U87为(19.0±2.2)个,T98G为(12.6±2.4)个,SF295为(4.0±2.)个,U251为(0.2±0.4)个,SKMG-4为0.Notch1在U87、U251、T98G、SF295、SKMG-4、C6、U373表达相关密度分别为0.34、0.21、0.79、0.04、0.28、1.75、1.19,与管道形成能力显著相关(r=0.778,P=0.019);Dll4表达相关密度与管道形成能力不相关(r=0.635,P=0.062).结论 Notch1蛋白表达与细胞株管道形成能力密切相关,而Dll4蛋白的表达与细胞株管道形成能力有待进一步探索.
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组织工程血管培养生物反应器出口端加载阻力的应力刺激形成系统的设计与验证
目的：改进组织工程血管（TEBV)培养应力形成系统，增强平滑肌细胞分泌的刺激作用。方法在生物反应器出口外侧加装阻力气泵，构建新的TEBV体外三维培养体系；通过压力导丝监测生物反应器内不同点压力变化，获得应力-时间变化曲线；按动态培养中是否添加阻力分成改进组和对照组，并设静态培养组，对动脉平滑肌细胞（VSMC）进行四周的三维培养；终止培养后采用HE染色、masson染色、α-SMA免疫组化染色及电子显微镜进行组织学检测，并运用软件对管壁成分进行半定量分析。结果压力监测数据及拟合曲线显示，添加阻力后可明显加大动力源“罗叶泵”每搏的应力刺激；培养结果显示改进组新生组织中VSMC及胶原纤维密布于管壁全层，细胞分布及密度、胶原纤维含量及排列、α-SMA表达均显著优于对照组及静态组。结论改进的系统应力刺激作用明显得到增强并可进一步促进VSMC分泌功能。
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人肝组织脱细胞支架的制备
目的：探究人肝组织脱细胞支架的制备。方法本研究利用手术切除的人肝血管瘤左外叶组织，经反复冻融，0.01%SDS、0.1%SDS和1%Triton X-100循环灌注制备人肝组织脱细胞支架，并通过灌注过氧乙酸消毒。将L-02细胞通过门静脉插管种植于脱细胞支架内进行培养。结果 HE、DAPI染色和扫描电镜结果显示脱细胞支架内无细胞成分残留，残余DNA检测为25.3±14.6 ng/mg干质量，小于新鲜肝脏DNA含量的1%。免疫组化证实支架内保留了Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、弹力蛋白成分。L-02细胞在支架上生长良好且有增殖，并表达白蛋白及葡萄糖-6-磷酸酶。结论利用手术切除的人肝标本行肝组织脱细胞支架的制备是可行的，且为构建更适用于临床的组织工程肝脏提供了新思路。
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肺癌细胞自分泌collagen Ⅰ在三维培养中促进肺癌细胞的生长
目的 研究肺癌细胞自分泌的胶原Ⅰ型(collagen Ⅰ)在肺癌细胞三维培养的作用.方法 通过免疫组化和RT-PCR证实肺癌细胞表达collagen Ⅰ;采用sh-collagen Ⅰ方法干扰肺癌细胞的表达,正常肺癌细胞作为对照组;用成纤维细胞的上清液刺激肿瘤,RT-PCR检测collagen Ⅰ的表达.结果 肺癌细胞分泌collagen Ⅰ;发现敲除collagen Ⅰ的肺癌细胞的三维生长受到限制:其生长率下降,三维培养中克隆形成减少.采用成纤维细胞培养细胞上清液刺激肿瘤细胞,肺癌肿瘤细胞自分泌的collagen Ⅰ表达发生改变,肿瘤自分泌的collagen Ⅰ可以维持自身生长的需要并受到微环境中非细胞外基质的调控.结论 肺癌细胞自分泌的collagen Ⅰ对肿瘤的生长有着重要作用.
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Avastin对肺癌诱导的肺微血管生成的影响
目的建立肺微血管内皮三维培养系统,观察抗血管内皮生长因子(VEGF)的人源化单克隆抗体Avastin对肺癌诱导的肺微血管生成的效应,并探讨其作用机制.方法通过血管生成抑制实验和采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化,观察Avastin对肺微血管内皮细胞的影响.结果随着Avastin作用浓度的增加,无血管结构区域的面积亦增加,由25μg/ml时的(0.944±0.073)cm2增加为100μg/ml的(5.189±0.192)cm2,凋亡率亦由(32.5±1.5)%增加为(39.2±1.6)%,并阻滞LVEC于G0/1期边界,造成细胞周期停滞,同时引起S期和G2/M期细胞比例显著降低.结论Avastin可抑制肺癌诱导的肺微血管内皮细胞的生长,并诱导细胞凋亡的发生,可能与Avastin阻滞LVEC于G0/1期边界,造成细胞周期停滞有关.
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新型生物反应器用于构建组织工程血管的初步探索
目的 设计一种实用的生物反应器,并探讨把它应用于组织工程血管(TEBV)培养的可行性.方法 根据国外文献所报道的基本原理,设计一种实用的生物反应器,把人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)接种到管状聚乙醇酸(PGA)无纺布培养支架上,放入生物反应器内进行三维压力培养,2周后收获培养新生物,肉眼观察大体外观并拍照记录,扫描电镜检测表面形貌.结果 VSMCs在生物反应器内经2周连续培养初步形成一条血管样组织.新生组织外观光滑平整,色泽鲜亮,具有一定厚度和弹性,能自我维持管腔形态.扫描电镜显示组织合有丰富的细胞外基质(ECM),PGA无纺布已被ECM完全包裹,管壁有未降解的PGA碎片.结论 设计的生物反应器符合组织工程培养的要求,未来可以用其进行构建TEBV的进一步研究.
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人脐带间充质干细胞在水凝胶支架上体外培养的浓度优化
目的:研究不同浓度RADA16-Ⅰ水凝胶支架对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)形态和增殖活性的影响,探讨佳水凝胶浓度.方法:采用组织块培养法进行hUC-MSCs培养,以不同浓度水凝胶(1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.125％)包封细胞构建的三维培养系统为实验组,不使用水凝胶的普通二维培养为对照组;倒置显微镜下观察各组细胞形态;采用MTT法检测细胞的增殖情况.结果:细胞在水凝胶中呈团状生长,二维培养中呈扁平梭形生长.MTT结果显示,二维培养组缅胞在3～6d进入对数生长期,6d后进入平台期.而各实验组细胞在水凝胶中经过几天的潜伏适应期,第6～9天进入对数生长期.三维水凝胶材料能促进脐带间充质干细胞的黏附、生长,细胞在低浓度水凝胶中的生长速率比在高浓度水凝胶中高(P≥0.05),其中0.25％的水凝胶支架材料细胞相容性和生物活性良好,适于间充质干细胞黏附和生长,并能促进细胞增殖.结论:RADA16-Ⅰ水凝胶具有良好的生物相容性,适宜人脐带间充质干细胞生长的水凝胶支架佳浓度为0.25％.
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不同支架材料培养前列腺癌PC3细胞的比较
目的:比较海藻酸钠加明胶、胶原、琼脂糖、基质胶等4种支架材料培养前列腺癌PC3细胞效果.方法:将前列腺癌PC3细胞接种到海藻酸钠加明胶、胶原、琼脂糖、基质胶等4种支架材料中进行三维培养,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测MMP9、MMP2、FN1、LAMA5、LAMC2、NKX3 1等6个前列腺癌相关基因在上述4种支架材料培养的PC3细胞的表达情况.结果:MMP9、MMP2在有支架材料培养的PC3细胞中表达高于无支架材料培养的PC3细胞;LAMC2、MMP9、MMP2在胶原组中上调,MMP9、MMP2在海藻酸钠加明胶组与琼脂糖原组中上调,基质胶组中只有MMP2上调.结论:①采用支架材料的三维培养体系优于不用支架材料的二维培养体系.②胶原为体外前列腺癌PC3细胞三维培养的优支架材料.
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Pellet体外三维培养模型种子细胞优化的实验研究
目的:研究构建牛角膜基质细胞体外三维培养模型Pellet中种子细胞的选择.方法:分离原代牛角膜基质细胞,分别选取p0、p1牛角膜基质细胞作为种子细胞,分为两组(p0组、p1组)进行Pellet模型的构建,以含10%FBS(fatal bovine serum)的DMEM培养基培养2周,大体观察培养模型生长趋势;培养3周行HE及MASSON染色,观察细胞活性及细胞外基质的形成情况.结果:p0组Pellet模型构建不成功,2周后观察细胞未见明显抱团生长,震荡易松散,无法进行HE及MASSON染色.p1组Pellet模型构建成功,培养2周后大体观显示,细胞明显抱团生长,呈粒状,震荡不散开.培养3周后HE染色显示,细胞密集生长,细胞团中坏死细胞极少;MASSON染色显示可以形成细胞外基质.结论:第一代牛角膜基质细胞可以作为种子细胞成功构建Pellet体外三维培养模型.
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三维条件下类器官培养的研究进展
类器官是成熟器官来源的三维上皮结构,包含干细胞或祖细胞,能够独立扩增并且分化为器官特异性上皮.利用三维方法培养类器官技术在组织再生、研究机体生理病理学、构建疾病模型及药物筛选等方面均有广阔的前景应用.本文将就三维条件下类器官培养的基础、应用和前景作一简要综述.
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三维培养与角膜基质组织工程学研究进展
二维平面是常见的体外细胞培养方式,其支持细胞生长的底物是由聚苯乙烯或玻璃制成,所提供的培养平面是扁平的,这是绝大多数研究中细胞的生长与黏附的形式.但由于二维培养并不能真正显现组织中的细胞外基质,很多在二维培养中的生理反应,如受体表达、转录表达、细胞移行及凋亡已被证实和实际器官或组织所发生的情况很不一样.而且细胞从分裂、增殖、迁徙和凋亡,是一连串被精确调控的事件,有赖于其内部固有的空间立体及时间上的组织原则.
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干细胞体外三维培养的研究进展
胚胎干细胞(ESCs)、造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)等属于全能或多能干细胞,具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能,可在特定条件下诱导分化为巨核细胞、骨细胞、生殖细胞等[1-2].
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三维培养hESCs来源视杯样组织中c-kit和SSEA-4的时空表达特点研究
目的 研究人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)三维培养后形成的视杯样组织中c-kit和SSEA4表达的时空特性.方法 H1人胚胎干细胞行三维培养和神经诱导分化,在分化7、14、21、30、49、70、90 d固定组织并行免疫荧光鉴定检测c-kit和SSEA-4的表达,同时在相应时间点将分化组织消化成单细胞行流式细胞仪检测验证.结果 三维培养第14天可见Rax+视泡(optic vesicle,OV)样结构,第30天形成具有内层Pax6+、外层Mitf+的双层视杯样(optic cup,OC)结构,第90天可见部分Crx+细胞.c-kit主要表达于hESCs来源OV状及OC状的神经上皮样结构中,SSEA-4早期均匀表达于整个组织,晚期则主要集中于周边部.c-kit+细胞比例呈先升高(P＜0.01)后下降(P＜0.01)趋势,并在分化14 d达40％的峰值.SSEA-4+细胞比例从分化0d至70 d持续下降(P＜0.01),直到90 d一直维持于该低水平.结论 在三维培养hESCs来源OV或OC状组织中,c-kit基因随诱导分化而激活,且主要表达于神经上皮层,呈先增高后下降趋势.SSEA-4早期高表达于整个组织,之后逐渐减少至周边部并维持于低水平状态.
