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量子点:新的荧光标记物质
随着人类基因组计划的完成,细胞蛋白组学、细胞图谱蛋白组学要求对细胞亚区、亚结构的蛋白组成及其相互作用网络进行动力学分析,而荧光图像技术是进行这一研究的重要手段.有机荧光染料易于淬灭,瞬时即逝,无法对标记细胞进行长期的追踪及观察标记分子的动力学过程.荧光蛋白标记可以克服上述困难,但需使用基因工程技术制备可表达融合蛋白的质粒,进行细胞培养、基因转染等一系列操作,非一般实验室所能完成,而且,如要同时标记细胞中的不同蛋白则需构建多种含不同特性荧光蛋白的融合质粒,更增加了实验难度.近出现的纳米晶体(nanocrystals)即半导体微粒--量子点(quantum dots)标记技术,以其独特的优点引起人们极大注意.
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抗结核DC疫苗的初步研究
目的:研制抗结核的新型疫苗(DC疫苗).方法:无菌分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,以rGM-CSF及rIL-4诱导分化获得树突状细胞(DC),以pEGHsp65融合质粒转染DC,共聚焦激光扫描显微镜检测转染率,继以电镜鉴定细胞形态、流式细胞术分析组合性表面分子表达、混合淋巴细胞反应(MLR)检测体外刺激T细胞增殖的功能.将制备的DC疫苗静脉接种正常同系小鼠,分别取各脏器冰冻切片后荧光显微镜观察;取小鼠静脉血用ELISA法检测IL-12及IFN-γ的表达量.结果:24 h DC转染率约20%,电镜可见细胞呈典型毛刺状突起,流式细胞分析表明转染后的DC表面MHCⅡ、33D1的表达量均呈显著增高.MLR显示,pEGHsp65转染DC组与pEGFP-C1转染DC组及空白DC组比较呈统计学增高.脏器冰冻切片显示,接种pEGHsp65转染DC小鼠组及pEGFP-C1转染DC小鼠组与未转染DC组比较,在各脏器分布中,以脾脏分布显著增高.其余脏器分布无显著差别.pEGHsp65转染DC小鼠组IL-12及IFN-γ表达量显著高于pEGFP-C1转染DC小鼠组及未转染DC小鼠组,P＜0.05,未转染DC组与阴性对照组相比,IL-12及IFN-γ表达量也有统计学增高,P＜0.05. 结论:pEGHsp65制备的DC疫苗具有成熟表型及功能,能够刺激小鼠IFN-γ及IL-12分泌增高.
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pET32a-PTEN融合质粒的构建与表达
目的：构建PTEN原核融合质粒，利用原核表达体系表达PTEN蛋白。方法：从人新鲜外周血中提取总RNA，采用逆转录和聚合酶链反应等分子生物学技术扩增PTEN编码区基因，并将其pET32a质粒融合，化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆。将鉴定正确的pET32a-PTEN融合质粒转化入表达菌株BL21，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其蛋白表达，SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况。结果：菌落PCR及DNA测序证实目的基因与质粒完整融合；融合质粒成功转入表达菌株BL21（DE3），SDS-PAGE和Western-Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出73 kDa左右的蛋白。结论：成功构建融合质粒，并且PTEN全长蛋白在原核表达菌BL21中完整、高效表达。
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HBsAg与结核杆菌热休克蛋白70融合质粒在真核细胞中的表达
目的探讨HBsAg与结核杆菌热休克蛋白70(Mt.HSP70)融合表达质粒在真核细胞中的表达.方法用真核表达质粒pCI-neo作为载体构建HBsAg及其与Mt HSP70的融合表达质粒(pCI-S,pCI-S-HSP70);用脂质体介导的转染法将重组质粒转染HepG2细胞,48 h后,采用RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA检测重组质粒在HepG2细胞中的表达.结果质粒pCI-S和pCI-S-HSP70转染的HepG2细胞总RNA用RT-PCR可检测到目的基因mRNA的表达:pCI-S和pCI-S-HSP70转染的HepG2细胞用免疫细胞化学检测,结果显示在胞浆及核周有大量的阳性颗粒;ELISA检测pCI-S转染的细胞培养上清液HBsAg为阳性,而pCI-S-HSP70转染的细胞培养上清液HBsAg为阴性;在细胞裂解液中,二者转染的细胞均为阳性.结论HBsAg与Mt.HSP70的融合表达质粒可在HepG2细胞中表达,但表达的融合蛋白不分泌出细胞外.
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pVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒的构建及表达
目的 构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(human α-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达.方法 RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位基因融合,在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG).将融合产物克隆到真核表达载体PVAX1上,利用电泳和测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列.采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blotting技术检测其表达.结果 电泳和测序结果与预期一致,并命名为PVAX1-IL-4/SYN-B;质粒转染COS-7细胞株成功,并且能在细胞内高效表达.结论 成功构建PVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒,并在哺乳动物COS-7细胞中高效表达,为研究融合质粒在帕金森病动物模型中的免疫效果奠定了基础.
