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骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达
目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础.方法从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过Bgl Ⅱ和Pst Ⅰ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP.利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆.结果成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记.结论真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础.
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MMP-9、BSP与LRP在乳腺癌组织中表达的意义及相关性研究
目的 探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、骨唾液蛋白(BSP)与肺耐药蛋白(LRP)在乳腺癌组织中的表达状况及与相关因素年龄、淋巴结转移、骨转移、C-erbB-2的关系.方法 应用免疫组化SP法检测60例乳腺癌与60例正常乳腺组织中MMP-9、BSP 与 LRP的表达,并对三者在乳腺癌组织中的表达与年龄、淋巴结转移、骨转移、C-erbB-2的临床关系进行分析.结果 乳腺癌组织中MMP-9、BSP与LRP的阳性表达率分别为75.0%、78.3%、68.3%;正常乳腺组织中MMP-9、BSP 与 LRP的阳性表达率分别为21.7%、15.0%、10.0%,差异有统计学意义(P ＜ 0.05).MMP-9表达与淋巴结转移、C-erbB-2表达有关,BSP表达与年龄、骨转移表达有关,LRP与C-erbB-2表达有关,差异有统计学意义(P < 0.05).结论 MMP-9、BSP、LRP在乳腺癌组织中高表达与乳腺癌的浸润和转移密切有关,能指导判断乳腺癌及其侵袭、转移、预后.
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骨唾液蛋白诊断乳腺癌骨转移的临床意义
文献报道,约80%的乳腺癌患者尸检发现有骨转移,而且在Ⅰ期乳腺癌患者中就检出23%临床骨转移隐匿病变.临床中这些乳腺癌骨转移患者在发病早期大多无骨痛症状,X线亦无骨破坏征象,一旦发现多数已属晚期,治疗很困难.有文献报道,骨唾液蛋白(bone sialoprotein BSP)主要来源于肿瘤细胞,而且在转移瘤细胞靶向转移至骨的过程中发挥了重要作用,故在众多乳腺癌骨转移标志物中,显示了较高的灵敏性及特异性.
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四通道骨唾液蛋白压电免疫传感器阵列的研制
背景:骨唾液蛋白是细胞外基质中的一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,其血清表达水平的检测在评估骨代谢水平方面具有重要的临床检测价值.目的:以AT切型、10Hz双面镀金的石英晶体为换能器,拟制作一种4通道压电蛋白芯片阵列,用于检验临床血清中骨唾液蛋白的表达水平.设计、时间及地点:观察实验,于2008-12/2009-07在解放军广州军区广州总医院医学实验科生物传感器实验室完成.材料:实验所用压电免疫传感器包括包被过的石英晶体、振荡器和频率计等.骨质疏松症患者血清(n=10)、正常人血清(n=9),参考标准血清由解放军广州军区广州总医院检验科、血液中心提供.小牛血清、胎牛血清为Hydone公司产品.方法:石英晶体的厚度切片模式采用AT切割,10MHz,大小为8.00mmx8.00mmx0.15mm,在石英晶片的双面采用真空镀膜的方法形成金电极,该阵列由弹簧支架以及4个石英晶体组成.采用双功能试剂Sulfo-LC-SPDP将鼠抗人骨唾液蛋白单克隆抗体巯基化,固定于石英晶体的金电极表面,通过免疫反应检测血清中骨唾液蛋白的表达.主要观察指标:不同抗体浓度与抗体固定量之间的关系,临床患者血清与正常人血清之间骨唾液蛋白表达的差异.结果:①随着抗体浓度的增加,石英晶体频率响应值也随之增大.实验以80mg/L为抗体固定浓度,检测稀释度为1:4的参考标准血清,结果显示传感器阵列检测的佳pH值条件在7.4左右.对稀释度分别为1:9, 1:8,1:7,1:6,1:5,1:4,1:3,1:2的参考标准血清进行检测,结果显示在血清稀释度1:9-1:2的范围内,构建的骨唾液蛋白传感器阵列对血清检测的响应呈较好的线性关系,线性方程为△F =521.54c-46.548,相关系数为0.9703.②骨质疏松症患者血清中骨唾液蛋白的表达水平明显高于正常人血清(1=5.702,P<0.05).结论:实验研制的骨唾液蛋白压电免疫传感器阵列具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、特异性好等优点,可用于骨唾液蛋白的定量检测.
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骨髓间充质干细胞对高转移肝癌模型的干预
背景：骨髓间充质干细胞具备化学趋向性和归巢作用，对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及防止复发转移具有良好的效果。
目的：观察人骨髓间充质干细胞移植入动物模型对肝癌组织的影响情况及对肝癌转移潜能影响。
方法：制作高转移潜能动物模型，实验组在接种肿瘤后第7日开始尾静脉注射骨髓间充质干细胞，5×105/次，2次/周；对照组尾静脉注射骨髓间充质干细胞培养液，0.2 mL/次，实验开始后每4 d用测量肿瘤体积，肿瘤接种后14 d(2周)，21 d(3周)，28 d(4周)，35 d(5周)，42 d(6周)处死动物，称质量，取瘤块，称瘤质量，计算肿瘤质量抑制率。PCR检测动物模型标本转移相关因子骨桥蛋白、骨唾液蛋白、整合素αⅤ基因的表达，及肿瘤标本凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase3基因的表达。
结果与结论：第3周时肿瘤的质量抑制率效果好，随着时间的延长，肿瘤的抑制率逐渐下降。肝癌转移相关的生物学指标均呈逐渐下降趋势，代表肿瘤凋亡指标的因子呈两极分化表现，抗凋亡bcl-2因子呈逐渐下降的趋势，凋亡因子bax、caspase3呈逐渐升高的趋势。骨髓间充质干细胞对肝癌动物模型肿瘤抑制效能随时间而变化，骨髓间充质干细胞移植后第3周对肝癌抑制效果显著，随着时间的延长，抑制效能减弱。骨髓间充质干细胞对肝癌的转移潜能具有抑制作用。 -
基质金属蛋白酶-2和骨唾液蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系
目的 检测基质金属蛋白酶(MMP)-2和骨唾液蛋白(BSP)在甲状腺乳头状癌(PTC)组织中的免疫组织化学表达情况,探讨两者的表达与颈淋巴结转移的关系.方法 收集2010年4月—2011年10月间行甲状腺癌根治+颈侧方淋巴结清扫或中央组淋巴结清扫的121例PTC患者的石蜡切片,另取甲状腺良性结节和癌旁组织石蜡切片各30例,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法免疫组织化学染色对MMP-2和BSP进行染色,观察MMP-2和BSP免疫组织化学表达情况.结果 PTC组织中的MMP-2表达阳性率为75.2％(91/121),显著高于甲状腺良性结节组织中的56.7％(17/30)和癌旁组织中的26.7％(8/30,P值均＜0.05);PTC合并颈侧方淋巴结转移者的MMP-2表达阳性率为80.0％(28/35),显著高于PTC合并中央组淋巴结转移者的72.7％(40/55)和无淋巴结转移者的74.2％(23/31,P值均＜0.05);MMP-2对诊断甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为75.2％(91/121)、73.3％(22/30)、91.9％(91/99)和42.3％(13/30).PTC组织中的BSP表达阳性率为82.6％(30/35),显著高于甲状腺良性结节组织中的70.0％(21/30)和癌旁组织中的50.0％(15/30,P值均＜0.05);PTC合并颈侧方淋巴结转移、PTC合并中央组淋巴结转移和无淋巴结转移者的BSP表达阳性率分别为85.7％(30/35)、80.0％(44/55)和83.9％(26/31),三者间的差异无统计学意义(P值均＞0.05);BSP对诊断甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为82.6％(100/121)、50.0％(15/30)、87.0％(100/114)和30.0％(9/30).Pearson相关性分析显示,PTC组织中MMP-2与BSP表达具有相关性(C=0.86,P＜0.001).结论 MMP-2和BSP可作为临床诊断甲状腺乳头状癌的辅助指标,且MMP-2对筛选PTC颈侧方淋巴结转移高危人群具有潜在的临床意义.
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保留根面牙骨质对人牙周韧带细胞分化的影响
目的 观察保留健康牙骨质对人牙周韧带细胞分化的影响.方法 取正畸患者拔除的健康前磨牙,从牙根的近中和远中面釉牙骨质界下2 mm制备对称的5 mm×4 mm的牙片43对,随机分成观察组(保留牙骨质)和对照组(去除牙骨质)各43张.刮取牙周膜组织,按组织块贴壁法培养牙周韧带细胞,分离培养后,取两组各23张牙片,将细胞接种到牙片上共培养,制成PDLC-牙片复合体.7 d后刮除并收集PDLC-牙片复合体上的细胞,采用RT-PCR方法检测成牙骨质标记物牙骨质附着蛋白(CAP)和牙骨质蛋白23(CP-23)表达.取两组剩余的20张牙片制成细胞-牙片复合体放入半透明膜中,植入裸鼠体内,8周后比较两组牙片表面新形成的硬组织情况,并采用免疫组化方法观察骨桥蛋白(OPN)和骨唾液蛋白(BSP)表达.结果 观察组CAP和CP-23表达较对照组升高(P均<0.01).植入裸鼠体内,8周后观察组14张牙片显示原有牙骨质上有牙骨质样基质形成;新旧牙骨质间并未观察到裂隙.对照组17张牙片在牙根表面有纤维组织形成,并且新纤维组织和牙本质表面间均可观察到不同宽度的裂隙.新形成的牙骨质样基质中,骨桥蛋白和骨唾液蛋白均呈阳性.结论 保留健康牙根表面的牙骨质可能促进人牙周韧带细胞向成牙骨质细胞分化,有利于牙周组织愈合.
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hBSP稳定转染乳腺癌细胞的筛选和鉴定
目的 筛选和鉴定人骨唾液蛋白(BSP)的荧光蛋白非融合表达载体和膜靶向表达载体稳定转染的乳腺癌细胞,为BSP在乳腺癌骨转移中作用的进一步体内、外研究奠定基础.方法 经过4周400μg/ml G418的抗性筛选结合流式细胞仪荧光分选系统获得稳定转染乳腺癌细胞.采用RT-PCR、ELISA以及Western-blotting等方法检测和鉴定BSP在乳腺癌细胞中基因水平和蛋白水平的表达情况.结果 筛选获得的乳腺癌细胞中BSP得到稳定表达,以β-肌动蛋白为内参,与空白对照相比BSP蛋白在基因水平上灰度比值从0.446分别增加为0.993和0.942;同时ELISA和Western-bolt实验结果证明BSP蛋白分泌表达和细胞内表达的量也均有所提高.结论 稳定高表达BSP的乳腺癌细胞的获得为进一步BSP在乳腺癌骨转移中的作用的体内外试验研究奠定基础.
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人骨唾液蛋白膜靶向表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达
目的构建人骨唾液蛋白(BSP)膜靶向表达载体,并转染人乳腺癌细胞,筛选获得稳定转染细胞,为进一步体内外研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础.方法通过PCR的方法从pB-hBSP载体中亚克隆人骨唾液蛋白hbsp基因,定向克隆至细胞膜靶向定位真核表达载体pDisplayTM中,构建中间重组载体pDisplay-hB-SP,再次通过PCR的方法从构建的pDisplay-hBSP载体中亚克隆出膜靶向信号肽、hbsp以及细胞膜定位蛋白基因,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组复合载体pID-hBSP-EGFP,利用脂质体转染特异性骨转移的乳腺癌细胞.结果重组载体pDisplay-hBSP和pID-hBSP-EGFP插入目的片段的测序结果与Genbank中发表的BSP序列基本一致.结论成功构建了人骨唾液蛋白膜靶向表达载体,并且经转染后成功在特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO中表达.为下一步进行体内外试验研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础.
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骨唾液蛋白的糖基化与功能
骨唾液蛋白(bone sialoprotein,BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白,主要由成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞合成,其含量约占骨细胞外基质中非胶质蛋白质的15%[1-2].BSP的分布相对局限,主要在矿化组织特异性表达.在胎盘滋养层细胞、血小板和多种骨转移瘤中也能检测到BSP的表达.近年来的研究表明,BSP具有细胞黏附性能,参与细胞黏附、细胞转移和信号识别,不仅能介导成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞黏附于骨基质表面,BSP以及与整合素受体结合还直接影响癌转化细胞的转移能力,并对血管生成有促进作用.
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骨唾液蛋白与肿瘤骨转移
骨唾液蛋白(bone sialoprotein, BSP)是1972年首先从牛骨皮质中分离出的一种富含唾液酸的糖蛋白;至今已从人、牛、兔和猪的骨中相继分离出该蛋白.骨唾液蛋白主要由成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞合成,占骨基质非胶原蛋白含量的8%～12%.近年来的研究表明,BSP除了作为骨代谢的指标,参与矿化组织的羟基磷灰石晶体形成外,其与肿瘤骨转移的关系正引起人们的关注.
