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感染幽门螺杆菌的慢性萎缩性胃炎患者血清hs-CRP水平及其与Cag-A的关系
目的:探讨感染幽门螺杆菌(HP)的慢性萎缩性胃炎(CAG)患者血清超敏C-反应蛋白(hs-CRP)水平及其与HP细胞毒素相关基因CagA的关系.方法:以ELISA法检测CAG组患者血清hs-CRP水平和CagA-IgG,并与无临床症状(AS)感染者及健康对照者进行比较.结果:CAG组血清hs-CRP平均值(1.30±+0.34)mg/L明显高于AS组(0.19±0.03)mg/L和健康对照组(0.11±0.03)mg/L(P均<0.01),AS组血清hs-CRP平均值显著高于对照组(P<0.05);CAG组CagA+HP与CagA HP患者之间血清hs-CRP水平无明显差异,AS组CagA+HP与CagA-HP人选者之间血清hs-CRP水平亦无明显差异.结论:CAG组与AS组血清hs-CRP水平明显高于对照组.尽管HP感染可导致血清hs-CRP水平升高,但与是否表达CagA无关.
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幽门螺杆菌低分子质量外膜蛋白的基因克隆和重组载体构建
目的构建幽门螺杆菌26000u外膜蛋白的基因重组载体,为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础方法用PCR方法从Hp染色体DNA基因组扩增26000u外膜蛋白的基因片段,将目的基因、pQE30质粒同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接、转染以及筛选含插入片段的重组载体.结果经酶切、测序分析插入的基因片段为表达Hp26000u外膜蛋白基因,有1.1%碱基发生变异,以及1 51%氨基酸残基改变.与文献相比,其同源性高达98%.结论 Hp外膜蛋白基因克隆、重组载体的构建将有可能为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒的开发打下基础.
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IS6O6在中国人群感染幽门螺杆菌中的分布意义
目的探讨转座子插入元件IS606在中国人群感染幽门螺杆菌(Hp)中的分布特征及其与HP致病的相关性.方法采用PC,R方法,将82例临床分离培养的HP菌株,分成IS605阳性(32株)和IS605阴性(50株)两组,扩增IS606中的1000bp片段,同时设立阳性对照及阴性对照.结果IS606在中国人群感染Hp的82例中全部为阴性.结论作为转座子插入元件的IS606在中国人慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等不同疾病来源的Hp中均不存在提示中国人群感染的Hp几乎无IS606插入,IS606与中国人群感染HP的致病性似乎关系不大,且不存在IS605与IS606的双插入.
关键词： 螺杆菌感染/流行病学 螺杆菌 幽门/遗传学 DNA可移植因子 基因扩增 -
幽门螺杆菌vacA cagA基因亚型与抗生素耐药的关系
目的研究幽门螺杆菌(H.pylori)cagA vacA基因亚型及其与抗生素耐药的关系.方法用琼脂稀释法测定50例H.pylori临床分离株对克拉霉素,阿莫西林,替硝唑,甲硝唑的低抑菌浓度(MIC),并计算MIC50和MIC90值.用多重PCR鉴定H.pylori菌株的vacA(s1a,s1b,s2,m1,m2)及cagA的型别.结果克拉霉素,阿莫西林,替硝唑,甲硝唑对H.pylori的MIC50和MIC90分别为:＜0.016 mg@L-1,0.016 mg@L-1;0.016mg@L-1,0.047 mg@L-1;16.000 mg@L-1,52.000 mg@L-1;25.140mg@L-1,76.800mg@L-1.H.pylori菌株对克拉霉素,阿莫西林,替硝唑,甲硝唑的耐药率分别为0%,0%,20%和38%.在对替硝唑敏感的H.pylori菌株中,vacA s1a,s1b和s2型分别占50.0%,42.5%和7.5%;vacA m1和m2型占60.0%和40.0%;vacA sla/m1,s1b/m1,s1a/m2,s1b/m2和s2/m2型分别占32.5%,27.5%,17.5%,15.0%和12.5%;cagA+和cagA-型为87.5%和12.5%.在对替硝唑敏感的H.pylori菌株中,vacA s1a,s1b和s2型分别占50.0%,40.0%和10.0%;vacA m1和m2型占40.0%和60.0%;vacA s1a/m1,s1b/m1,s1a/m2,s1b/m2和s2/m2型分别占20.0%,20.0%,30.0%,20.0%和10.0%;cagA+和cagA-型为80.0%和20.0%.结论 H pylori菌株对甲硝唑的耐药率明显高于H.pylori对克拉霉素,阿莫西林,替硝唑的耐药率,不同cagA vacA基因亚型的H.pylori菌株对替硝唑的耐药率无显著差异.
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胃癌高低发区幽门螺杆菌菌株感染的地域特征
目的:为了比较胃癌高、低发区幽门螺杆菌(helibobactor pylori,Hp)毒力基因菌株感染的差异,进而揭示Hp菌株分布的地域性特征,探讨Hp感染的流行病学规律及其疾病相关性.方法:选取胃黏膜活检标本491例,其中庄河地区355例,沈阳地区136例.在微需氧的条件下,进行Hp培养,并用标准的酚-氯仿方法提取菌种DNA后,经聚合酶链反应及琼脂糖凝胶电泳对cagA、vacA和iceA基因亚型进行检测.同时取胃窦、体和角黏膜各一块,经石蜡包埋,HE染色,行组织病理学诊断.结果:vacA s1基因亚型在胃癌高发区的检出率为95.33%,与低发区的64.29%相比差异有统计学意义,x2=25.008,P=0.000.在高发区感染vacA slmlb型菌株有22例(20.56%),沈阳地区仅1例(2.38%),两者差异有统计学意义,x2=7.637,P=0.006.结论:辽宁省庄河、沈阳两地Hp菌株基因型的分布存在明显差异,感染高毒力型vacAsl或vacA slml菌株在庄河地区明显高于沈阳地区,此点可能是高发区胃癌发病率高的危险因素之一,对这种菌株的研究,可以为揭示Hp的致病机制提供线索.
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幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关基因片段的筛选及克隆分析
目的:筛选幽门螺杆菌(Hp)对甲硝唑耐药相关基因片段.方法:以5株临床分离的耐药株作为被检菌,1株敏感株作为参考菌,采用抑制差减杂交技术进行基因组差异研究,获取Hp对甲硝唑耐药相关的基因片段,并以斑点杂交方法对所获的基因片段进行了杂交鉴定.结果:在获得的差减阳性克隆中,经斑点杂交筛选后共有37个基因片段的拷贝数在耐药和敏感菌株中存在差异(2倍以上),而其中17个片段其拷贝数存在明显差异(3倍以上).对以上17个差异片段进行单向测序,根据高同源性比对结果,分别代表二肽ABC载体渗透酶(dppB)、二肽ABC载体结合蛋白(dppA)等10个基因的同源基因片段在耐药株中存在高拷贝数.结论:所获得的10个差异基因片段可能与幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关.
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幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测
目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA+Hp)感染与所致疾病种类的关系.方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp.采用PCR检测109株Hp cagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2 148 bp的cagA基因片段(cagA1).构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Western blot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性.建立ELISA,检测109株Hp CagA表达和相应患者血清中CagA抗体.分析CagA+ Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系.结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性.与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%.所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%.rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体.92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1% 患者(96/109)血清CagA抗体阳性.消化性溃疡标本中CagA+ Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05).结论:本实验构建的原核表达系统表达的rCagA1有良好的免疫反应性和抗原性,建立的ELISA可用于Hp CagA及其抗体的检测,分离的Hp菌株cagA基因携带率和CagA表达率均很高.消化性溃疡和胃炎与其感染的Hp是否表达CagA无明显关系.
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幽门螺杆菌ureA、ureB基因克隆、序列分析及在E.coli中表达
目的构建含幽门螺杆菌(Hp)ureA、ureB基因重组质粒,测定、分析其核酸序列及推定的氨基酸序列,在E.coli中高效表达两基因,为检测试剂和疫苗研究提供基础依据和抗原.方法 PCR法扩增Hp菌株HPSH4的ureA、ureB基因,分别与pGEX-2T载体连接并转化大肠杆菌JM105,测定克隆基因的核酸序列并与GenBank公布的国外5株Hp菌株(26695,HPK5,J99,CPM630,M60398)的ureA、ureB基因作序列比较,以IPTG诱导,ureA、ureB基因在E.coli中高效表达.结果 ureA核酸同源性96.3%～98.1%,氨基酸同源性98.3%～100%;ureB核酸同源性95.8%～ 98.0%,氨基酸同源性96.4%～99.6%.以IPTG诱导,在E.coli中表达rureA融合蛋白55 600 D,rureB融合蛋白85 500 D.结论不同地区Hp菌株的ureA、ureB存在程度不同的变异,克隆并表达HPSH4的ureA、ureB与GenBank已公布的多数Hp菌株有极高同源性,在E.coli以融合蛋白高效表达rureA和rureB.
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幽门螺杆菌细胞空泡毒素毒性片段基因的表达及其重组蛋白免疫学鉴定
目的采用基因工程技术获得具有良好免疫反应性的重组细胞空泡毒素的毒性亚单位蛋白.方法利用PCR技术从Hp基因组中扩增VacA基因毒性片段,插入原核表达载体pQE30上,测序后,转化表达宿主菌DH5α,SDS-PAGE分析表达情况,Western blot检测其免疫反应性.Ni-NTA2+树脂纯化后,用重组蛋白免疫兔,Helico Blot试剂盒检测兔血清VacA抗体以鉴定其免疫原性.结果测序表明目的序列完整,与Genbank中的多株中国菌株相比有高度的同源性.SDS-PAGE显示表达产物相对分子量为27 000,表达量为30%以上.该蛋白可被Hp全菌抗血清所识别,纯化后可得到纯度为93%以上蛋白质,并证实有良好的免疫原性.结论 Hp VacA基因毒性片段表达成功,获得高纯度重组蛋白并具有良好的免疫反应性与免疫原性,为研制疫苗和制备诊断VacA(+)株感染试剂盒提供了可靠材料.
