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敲除ADAR1抑制Notch1诱导小鼠T淋巴细胞白血病的发生
目的:探索ADAR1对于小鼠急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)发生发展的影响.方法:通过杂交繁殖获得Lck-Cre;ADAR1lox/lox小鼠及对照组ADAR11ox/lox小鼠;采用免疫磁珠法富集两组小鼠的lin-细胞,用携带MSCV-ICN1-IRES-GFP质粒的逆转录病毒分别感染上述lin-细胞,流式细胞术检测感染效率,分选并移植相同数量的GFP+细胞至受体小鼠中.在移植后持续观察并统计两组小鼠生存情况.结果:成功获得了T细胞特异敲除ADAR1的小鼠,并成功建立了Notch1诱导的小鼠T-ALL白血病模型.对照组小鼠在移植后发病,符合T-ALL特征;相反,ADAR1敲除组小鼠没有发生白血病.结论:ADAR1在Notch1诱导的T-ALL白血病的发生过程中起关键作用.
关键词： ADAR1 Notch1 急性T淋巴细胞白血病 条件性基因敲除 小鼠模型 -
ADAR1同工型基因在小鼠急性T淋巴细胞白血病模型中的表达
本研究探讨RNA编辑酶ADAR1的2种同工型P110和P150在小鼠白血病发展中的表达变化规律.采用Notch1过表达小鼠急性T淋巴细胞白血病移植模型,在发病不同阶段分离骨髓单个核细胞,并在发病晚期用流式细胞术分选CD45.2+GFP+白血病细胞,用实时定量PCR方法检测ADAR1的表达变化.结果表明:对照组和白血病组小鼠骨髓细胞均表达ADAR1的2种同工型P110和P150 mRNA;Notchl过表达导致的小鼠白血病发展过程中2种同工型的表达水平变化不同;随着白血病的发展,P110的表达水平逐渐升高,而P150表达水平逐渐降低,在移植后的第14天降至对照组的1/4.分选后的CD45.2+GFP+白血痛细胞高表达P110而低表达P150.结论:ADARl的亚型P11和P150 mRNA在小鼠白血病中的表达变化规律存在差异,提示二者介导的RNA编辑可能在白血病发展中发挥不同作用.
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RNA干扰下调ADAR1基因表达对肝癌细胞增殖能力的影响
目的 观察RNA干扰下调ADAR1基因表达对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 用小分子干扰RNA(siRNA)转染肝癌细胞SMMC-7721,RT-PCR法检测ADAR1 mRNA表达,Western blotting法测定ADAR1蛋白,MTT比色法检测SMMC-7721细胞增殖.结果 细胞转染24、48、72小时后,实验组ADAR1 mRNA相对表达量分别为0.612±0.086、0.264±0.018、0.156±0.063,对照组分别为1.032±0.107、0.898±0.092、0.968±0.074,差异具有统计学意义(P＜0.05);对照组与空白组ADAR1 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).实验组ADAR1蛋白相对表达量分别为0.684±0.079、0.324 ±0.042、0.145 ±0.058,对照组分别为1.002±0.092、0.917 ±0.068、0.972±0.073,差异均有统计学意义(P＜0.05);对照组与空白组ADAR1 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).细胞转染后SMMC-7721细胞增殖活性明显下降(P＜0.05).结论 ADAR1基因特异性siRNA干扰后,ADAR1 mRNA及蛋白相对表达水平显著下降,SMMC-7721细胞的增殖能力亦明显下降.
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ADAR1 shRNA对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响
目的:研究ADAR1 shRNA对人胶质瘤细胞U87细胞增殖和凋亡的影响.方法:通过构建ADAR1-shRNA的干扰质粒,经脂质体法转染胶质瘤U87细胞系,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选择转染效率高的细胞系.取转染48h细胞,采用RT-PCR和Western-blot分别检测ADAR1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测其细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖情况.结果:①经ADAR1-shRNA转染48h后的转染效率高,此时U87细胞系中ADAR1 mRNA及蛋白的表达均被显著抑制,较阴性对照组及空白组均明显降低(P＜0.05).(②在转染ADAR1-shRNA后,细胞凋亡率为(28.14％±3.76％),明显高于阴性对照组(3.20％±1.57％)和空白组(2.80％±1.49％),细胞增殖率较阴性对照组及空白组明显下降(P＜0.05).结论:通过shRNA抑制ADAR1的表达能明显促进人胶质瘤细胞U87细胞的凋亡和抑制其增殖,ADAR1基因可能成为治疗治疗胶质瘤的新靶点.
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RNA编辑酶ADAR1对EV71感染及变异的影响
目的 研究RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR1)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及变异的影响.方法 运用RNAi技术筛选ADAR1基因沉默稳定细胞株,通过MTT分析病毒感染后细胞活力变化、噬斑形成分析病毒滴度及细胞对病毒的敏感性,以及Western blot测定病毒蛋白表达水平等,分析ADAR1对EV71感染的影响.由于ADAR1介导的RNA编辑可使基因形成A-G或T-C突变,为确定ADAR1影响EV71感染是否与其编辑EV71基因组导致病毒变异有关,对EV71流行区EV71的突变特征进行分析;并利用EV71感染ADAR1基因沉默细胞,通过对病毒基因组测序分析,研究ADAR1是否直接编辑EV71基因组.结果 ADAR1基因沉默后,与对照细胞相比,病毒感染细胞的存活率下降更快,并形成更多、更大的噬斑.病毒感染细胞中的VP1蛋白和细胞培养基上清中的病毒滴度均明显增加.EV71突变特征分析表明,虽然A-G和T-C之间的变异是病毒突变的主要类型,但EV71感染实验初步证明,ADAR1并不直接编辑EV71病毒基因组.结论 ADAR1可能具有抗EV71感染的作用,但ADAR1可能并不直接编辑EV71基因组.
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遗传性对称性色素异常症2例基因诊断
目的:鉴定1例遗传性对称性色素异常症(dyschromatosis symmetrica hereditaria,DSH)患者ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA1)基因突变,并对该家系中一临床不典型病例进行基因诊断.方法:采集1例DSH患者及家族成员的外周血,应用直接测序的方法检测突变位点.结果:在患者10号内含子区域检测到1个剪接位点突变(c.2886-5T>C).另外,对该家系中临床表现不典型的患者,基因测序结果支持该病的诊断.结论:该研究检测到1例新的剪接位点突变,异常剪接方式为外显子的删除.并明确了该家系中临床不典型患者的诊断,在Wood灯下进一步确定了其临床表型.
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HaCaT细胞ADAR1基因沉默对Wnt11表达和A375细胞酪氨酸酶活性的影响
目的 探讨遗传性对称性色素异常症致病基因ADAR1对Wnt11表达和酪氨酸酶活性的影响.方法 将HaCaT细胞等细胞数量分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组.用3种针对ADAR1基因的shRNA质粒分别沉默3个实验组中HaCaT细胞的ADAR1基因,用Western印迹法检测4个组HaCaT细胞相关蛋白的表达水平.建立HaCaT细胞与黑素瘤细胞A375共培养模型,对实验组(HaCaT细胞中的ADAR1和Wnt 11蛋白低表达)与对照组(HaCaT细胞中的ADAR1和Wnt11蛋白正常表达)的细胞形态和酪氨酸酶活性进行比较.结果 蛋白印迹法发现,ADAR1基因沉默的HaCaT细胞中的Wnt 11蛋白条带灰度值明显低于正常HaCaT细胞中的Wnt 11蛋白条带灰度值,证实HaCaT细胞中的ADAR1基因沉默后,Wnt11蛋白的表达水平明显下降.在共培养模型中,实验组HaCaT细胞与A375细胞连接处的树突状突起明显少于对照组,实验组A375细胞的酪氨酸酶活性与对照组相比显著降低,减去空白组A值后,实验组A值为0.0168±0.0069,对照组为0.0490±0.0132,P＜ 0.01.结论 HaCaT细胞中ADAR1基因沉默可降低Wnt 11的表达,并影响A375细胞酪氨酸酶活性.
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一个遗传性对称性色素异常症家系ADAR1基因突变分析
目的 检测1个遗传性对称性色素异常症家系中ADAR1基因的突变位点.方法 提取一遗传性对称性色素异常症家系成员(5例患者,3例非患者)和100例无血缘关系的健康对照外周血标本,PCR扩增ADAR1基因全部15个外显子序列并测序,参考Genebank中ADAR1基因标准序列对比分析突变位点.结果 该家系5例患者ADAR1基因2号外显子第1 420位碱基C突变为T,为无义突变,即C.1420C＞ T(p.Arg474X),家系其他健康成员和100例无关健康人中未发现此突变.结论 该遗传性对称性色素异常症家系的致病突变为ADAR1基因C.1420C＞T无义突变.
关键词： 密码子 无义 基因 ADAR1 遗传性对称性色素异常症 -
遗传性对称性色素异常症一家系ADAR1基因新突变
目的:确定一遗传性对称性色素异常症家系ADAR1基因的突变位点.方法:提取家系中2例患者、2名表型正常者及50名与本家系无关的正常对照外周血DNA,采用PCR技术扩增ADAR1基因所有编码区并进行测序.结果:该家系中2例患者均存在ADAR1基因错义突变(c.662C>T),导致p.P211R改变,家系中2名未患病的个体和50名健康对照均未发现上述突变.结论:ADAR1基因c.662C>T错义突变是导致该家系发生DSH的致病性突变,在国内外属首次报道.
关键词： 遗传性对称性色素异常症 ADAR1 基因突变 -
8-氯腺苷调节RNA编辑酶ADAR1对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖和迁移的影响
目的:研究8-氯腺苷(8-chloro-adenosine,8-Cl-Ado)对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖和迁移的影响,以及与RNA编辑酶1 (adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1)表达的相关性.方法:蛋白印迹实验检测乳腺癌组织中ADAR1的蛋白表达量以及8-Cl-Ado(10 μmol/L)处理乳腺癌SK-BR-3细胞不同时间ADAR1蛋白表达量的变化;MTT法和形态学观察检测不加药组和8-Cl-Ado(10 μmol/L)加药组对SK-BR-3细胞增殖的影响;MTT法和伤口愈合实验检测SK-BR-3细胞过表达ADAR1质粒(空白对照组、空载组、ADAR1-P110组、ADAR1-P150组)对8-Cl-Ado作用SK-BR-3细胞增殖及迁移的影响.结果:乳腺癌癌组织中ADAR1-P110和ADAR1-P150蛋白表达量均明显高于癌旁组织(t=9.871,P=0.000;t=7.169,P=0.000);8-Cl-Ado作用SK-BR-3细胞48 h后ADAR1-P110和ADAR1-P150蛋白表达量均明显降低(t=-8.838,P=0.013;t=-19.866,P=0.003);8-Cl-Ado作用SK-BR-3细胞ADAR1-P110组和ADAR1-P150组48 h后增殖抑制率均明显低于空白组(P均为0.000);8-Cl-Ado作用SK-BR-3细胞ADAR1-P110组和ADAR1-P150组48 h后的迁移率均明显高于空白组(P均为0.000).结论:8-Cl-Ado能明显抑制SK-BR-3细胞增殖和迁移,其作用机制可能与ADAR1的表达下调有关.
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RNA编辑酶ADAR1对淋巴细胞系增殖的影响
目的探索ADAR1活性升高对淋巴细胞细胞增殖的影响.方法①构建反转录病毒载体:PCR从小鼠cDNA中放大ADAR1全长基因,连入反转录病毒MIEV载体,感染包装细胞后分泌病毒颗粒;②病毒颗粒感染T淋巴细胞CTLL2和B淋巴细胞A20,观察细胞增殖的变化;③MTT法测定细胞增殖率.结果 ADAR1/MIEV病毒感染淋巴细胞后,使细胞增殖速度减慢.结论 ADAR1在淋巴细胞发挥功能方面起有重要的作用,但哪些物质需要编辑以及具体机制如何,需要进一步研究.
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ADAR1与非编码RNAs的研究进展
作用于 RNA 的腺苷脱氨酶1(adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1,ADAR1)是 RNA编辑酶家族成员之一,其可催化双链 RNA 上腺嘌呤转换为次黄嘌呤,并将次黄嘌呤识别为鸟嘌呤,与胞嘧啶配对[1]。ADAR1介导的 A-to-I RNA 编辑作为一种重要的转录后修饰方式,改变了遗传信息,从而产生蛋白质结构及功能的多样性,成为中心法则的一个重要补充。人类 ADAR1基因位于染色体1q 21.3,全长30 Kbp [2],广泛存在于哺乳动物体内,与胚胎发育、造血系统维护、免疫调节及疾病的发生发展密切相关。近期,高通量测序结果发现,上百万个 A-to-I RNA 编辑位点位于非编码区域,说明 ADAR1与非编码 RNAs 之间存在密切联系。
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小鼠原代淋巴细胞增殖过程中RNA编辑酶ADAR1的变化
目的探索淋巴细胞增殖时RNA编辑酶ADAR1的变化.方法①ADAR1底物的合成,利用含有α-tropomyosin基因的质粒pBluescriptSK(+/-),体外转录的方法,合成双链RNA底物,掺入α-32P-ATP标记;②分离小鼠脾脏和淋巴结内的淋巴细胞,加入IL-2/ConA刺激淋巴细胞增殖,于不同的时间点收取细胞,裂解后用合成好的底物测定ADAR1的活性;③应用薄层色谱,观察细胞裂解物作用后的RNA中有多少腺嘌呤核苷变成了次黄嘌呤核苷;④用MTT法测定细胞的增殖率.结果加入IL-2/ConA 的淋巴细胞与未加入的比较,前者于30 h起ADAR1的活性升高,72 h达高峰,其变化与细胞增殖曲线相一致.结论首次发现淋巴细胞增殖过程中ADAR1的活性升高,说明ADAR1在淋巴细胞功能方面可能具有重要作用.
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电穿孔与脂质体 lipofectamine 转染 miR －218进入肝癌细胞效率的比较
目的：比较采用电穿孔和脂质体 lipofectamine 两种方法转染人肝癌细胞的效率优劣。方法：分别采用电穿孔和脂质体转染 miR －218进入人肝癌细胞 HepG2，采用 RT －PCR、Western blot、流式细胞仪、Tunel 检测等方法比较两种方法的转染后对人肝癌细胞的影响。结果：采用两种方法都可以成功将 miR －218转染进人肝癌细胞 HepG2中，降低了 HepG2中 miR －218靶基因 RNA 编辑酶 ADAR1的表达，使得细胞凋亡增加，但电穿孔转染组效率更高。结论：电穿孔转染是一种安全、高效的转染方法，值得推广。
