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三七总皂苷对拟缺血脑微血管内皮细胞RIG-Ⅰ表达的影响
目的:研究三七总皂苷对拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞维甲酸诱导基因-Ⅰ(Retinoic Acid-inducible Gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的影响.方法:采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cell,BMEC),氧糖剥夺法制备拟缺血损伤模型,首先用不同浓度梯度的三七总皂苷进行干预,筛选出三七总皂苷的佳用药浓度,然后分别采用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中RIG-Ⅰ mRNA及蛋白的表达水平.结果:三七总皂苷在22 μg/mL浓度时能够显著提高拟缺血损伤脑微血管内皮细胞的活性,同时能够从基因和蛋白水平下调RIG-Ⅰ的表达.结论:三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞具有保护作用,提示三七总皂苷在缺血性脑损伤中使RIG-Ⅰ的表达下调可能是其发挥抗炎作用的内在分子机制之一.
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维甲酸诱导基因-Ⅰ诱导干扰素的产生在乙型肝炎病毒感染清除中的作用
目的 探讨维甲酸诱导基因-Ⅰ(RIG-I)在诱导HBV感染IFN产生中的影响,以期对阐明乙型肝炎慢性化机制,寻找新的治疗靶点提供新的思路.方法 以RIG-I表达载体flagRIG-I-fult转染培养6孔板中的HepG2、HepG2.2.15,24 h后用水疱性口炎病毒(VSV)感染细胞,然后在0、8、16和24 h收集细胞及培养上清液,采用quantitive RTPCR、Western印迹检测RIG-I、MDA5、IPS-1、ISG54等基因的表达,ELISA检测培养上清液中分泌的IFN-β水平.结果 HepG2.2.15细胞在VSV感染后IFN-β分泌水平(11.18±1.34) pg/mL明显低于HepG2细胞(275.50±22.97) pg/mL (P＜0.01)；通过质粒flagRIG-I-ful1转染高表达RIG-I后,HepG2.2.15分泌IFN-β的能力恢复至(548.78±57.99) pg/mL 与HepG2细胞(532.10±39.34) pg/mL接近的水平(P=0.7013).结论 HepG2.2.15细胞感染VSV后IFN产生障碍,高表达RIG-I后IFN表达水平得到恢复,提示RIG-I功能缺陷导致抗病毒免疫应答降低,RIG-I可能在HBV感染清除中起重要作用.
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乙型肝炎病毒e抗原对Bewo细胞RIG-Ⅰ和MAVS表达的作用
目的 探讨乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)对Bewo细胞维甲酸诱导基因-I(retinoic acidinducible-Ⅰ,RIG-Ⅰ)和线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)表达的作用.方法 首先以终浓度2 μg/mL的RIG-Ⅰ配体poly(dAT∶dAT)处理Bewo细胞24 h,观察RIG-Ⅰ、MAVS mRNA的表达.然后将5μgHBeAg重组质粒pcDNA3.1 (+)-HBe转染Bewo细胞,转染48 h后,以2μg/mL的poly(dAT∶ dAT)刺激24 h.采用实时荧光定量反转录PCR和酶联免疫吸附测定分别检测细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA表达及上清干扰素-β(interferon-β,IFN-β)水平.并采用免疫荧光染色法观察HBeAg对细胞核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)p65入核的影响.结果 poly(dAT∶ dAT)可诱导Bewo细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA表达(27.86±9.49,21.75±8.04),高于对照组(14.51±6.27,11.59±4.73)(P＜0.01).转染5μg HBeAg重组质粒组poly(dAT∶ dAT)可诱导Bewo细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA表达(13.33±4.23,10.48±3.17)及IFN-β产生[(14.20±5.01)pg/mL],低于对照组[27.86±9.49,21.75 ±8.04;(47.69± 14.3)pg/mL](P＜0.01),但与pcDNA3.1-HBe-5组[11.82±3.58,9.39±3.22;(10.82± 3.75)pg/mL]比较,差异无统计学意义(P＞0.05).且HBeAg可干扰poly(dAT∶dAT)诱导Bewo细胞NF-κB p65入核,抑制NF-κB的激活.结论 HBeAg可下调Bewo细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA的表达,并抑制NF-κB入核及IFN-β产生,这可能是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)逃避宿主免疫应答的一种重要策略.
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RIG-Ⅰ配体poly(dAT:dAT)诱导Bewo细胞抑制乙型肝炎病毒复制的研究
目的 探讨维甲酸诱导基因-I(retinoic acid inducible gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)配体poly(dAT:dAT)抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的作用及机制,为防治HBV宫内感染提供依据.方法 首先将2μg1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞12h后,以RIG-Ⅰ配体poly(dAT:dAT)处理24h.然后,以poly(dAT:dAT)处理Bewo细胞,观察干扰素-β(interferon-β,IFN-β)表达的动力学.采用微粒子酶免疫分析法和荧光定量聚合酶链反应法分别检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平,并以酶联免疫吸附测定和逆转录PCR分别检测IFN-β水平,RIG-Ⅰ、线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)、干扰调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF 3)和核因子-κB(NF-κB)的表达.结果 poly(dAT:dAT)可显著诱导Bewo细胞产生IFN-β(P<0.05),呈时间和剂量依赖性.与对照组比较,poly(dAT:dAT)处理组HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平显著下降(P<0.05),可显著抑制Bewo细胞中HBV复制.且poly(dAT:dAT)可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达RIG-Ⅰ、MAVS、IRF 3和NF-κB mRNA.结论 通过RIG-Ⅰ/MAVS信号途径诱导Bewo细胞产生IFN-β,RIG-Ⅰ配体poly(dAT:dAT)可显著抑制HBV复制.
关键词： 维甲酸诱导基因-Ⅰ 线粒体抗病毒信号蛋白 乙型肝炎病毒 病毒复制 信号传导
