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腹泻性贝毒软海绵酸单克隆抗体的制备和酶联免疫检测方法的建立
采用细胞融合技术制备抗赤潮毒素腹泻性贝毒软海绵酸的单克隆抗体,应用此抗体发展建立了软海绵酸的间接竞争酶联免疫检测方法.采用碳二亚胺法,将半抗原与载体蛋白偶联,得到免疫抗原和包被抗原.免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA方法筛选阳性克隆,经多次克隆化,获得了4株能稳定分泌抗软海绵酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过小鼠体内诱生腹水方法获得单克隆抗体,建立分析检测软海绵酸的间接竞争酶联免疫方法.低检出限为31.2ng/ml,批内平均变异系数8.1%,回收率为87%～112%.
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海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究
目的 建立间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中赤潮毒素记忆缺失性贝毒主要成分软骨藻酸(DA).方法 采用碳二亚胺法,将半抗原DA分别与载体蛋白卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原.以DA-BSA做为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法分析检测海水样品和海洋贝类中的软骨藻酸.结果 低检出限为10.0ng/ml(对于贝相当于4μg/g);海水样品回收率为83.2%～124.7%,批内变异系数在4.7%～5.9%之间;贝类样品回收率为85.9%～99.9%,批内变异系数2.4%～7.1%之间.结论 建立的ELISA方法检测海洋贝类中DA可以满足国际规定的安全限值.
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剑叶龙血素A间接竞争ELISA检测方法的建立
目的:建立间接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于测定剑叶龙血素A(CA)含量.方法:合成半抗原剑叶龙血素A-4'-羧甲基醚(CA-4'-CME),再用碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)分别偶联制备免疫原(CA-BSA)和包被原(CA-OVA),免疫小鼠制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA法并评估其分析性能.结果:通过紫外扫描分析CA-BSA和CA-OVA的偶联比分别为18∶1和24∶1.抗血清效价高达到12000.用四参数logistic方程拟合CA标准曲线,在分析范围0 ～0.80 mg·L-1内,相关系数(R2)≥0.99,IC500.66 mg·L-1,低检测限0.045 mg·L-1,批内CV≤12.5％,批间CV≤14.7％,回收率92.7％ ～ 118.7％,对5种CA类似物的交叉反应率＜5.38％.此方法检测龙血竭和龙血竭总黄酮中CA含量分别为1.27％,3.08％.结论:剑叶龙血素A间接竞争ELISA法精密度、准确度和特异性均较好,可方便地用于药物检测和分析.
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冠心病患者血浆OLAB、BNP和CRP水平变化分析
检测冠心病患者血浆OLAB、BNP和CRP水平变化, 探讨冠心病发病机制及不稳定性心绞痛(UAP)治疗前后对其影响.用RIA和ELISA法对124例冠心病患者和30名对照者血浆中的OLAB、BNP和CRP水平变化及相关性进行研究, 同时对48例UAP经皮冠状动脉形成术(PTCA)治疗前、后对上述三项指标的变化进行分析; 结果表明冠心病患者与对照组比较BNP水平有显著性差异(P＜0.01),尤其是AMI和UAP组比SAP组升高更明显; CRP水平比对照组明显增高(P＜0.05),特别是不稳定性心绞痛和AMI组升高明显(P＜0.05);AMI组血浆OLAB水平明显高于正常和其他两组, OLAB、BNP和CRP三项在UAP组中治疗前后比较差异显著(P＜0.01).总之,OLAB、BNP和CRP参与了冠心病的发病过程, 并可预测心肌梗死患者远期心功能恢复的情况, UAP组经PTCA支架术后, 三项指标均明显降低, 可作为疗效观察的一个重要参数, OLAB参与了冠状动脉粥样硬化的全过程及AMI的发病始末.
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骨碱性磷酸酶(BAP)酶联免疫吸附分析方法的建立及初步应用
目的 建立骨碱性磷酸酶(BAP)酶联免疫吸附分析方法(ELISA).方法 使用两株抗体,一株包被微孔板,另外一株用HRP标记.显色系统使用TMB显色.结果 测定范围在5～ 120ng/mL,低检测限在1.5ng/mL,回收率在96.4％～ 102％之间,批内和批间变异分别为5.6％和7.9％,正常参考值为＜10ng/mL,用502份临床样本考核本试剂盒,与参比试剂盒有很好的临床符合性,与参比试剂盒具有同等的临床使用价值.
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肝活素酶联免疫吸附分析方法的建立及应用
目的 建立肝活素(Hepassocin)酶联免疫吸附分析方法(ELISA).方法 使用两株抗体,一株包被微孔板,另外一株用HRP标记.显色系统使用TMB显色.结果 测定范围在20 ～ 1000ng/mL,低检测限在10ng/mL,回收率在93.9％～ 103.1％之间,批内和批间变异为9.7％和7.8％,正常参考值为＜20ng/mL.结论 用1000份临床样本考核本试剂盒,与参比试剂盒有很好的临床符合性,与参比试剂盒具有同等的临床使用价值.
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人血清抵抗素ELISA方法的研究及其临床初步应用
用兔抗人抵抗素(resistin)片断(22～34氨基酸残基)的多克隆抗体(PcAb)包被固相板,用辣根过氧化物酶(HRP)标记PcAb得HRP-PcAb.在包被PcAb的孔中加入抵抗素标准品(或待测样品),加入HRP-PcAb,形成PcAb-resistin-HRP-PcAb复合物,加酶底物邻苯二胺(OPD)显色,用酶标仪在492nm波长处测定OD值,绘制标准曲线.从标准曲线读出样本中抵抗素含量.本方法特异性强,灵敏度高,精密度好.该法测定范围0.5～100ng/mL,低检出量0.5ng/mL,批内和批间CV%分别为3.4%和7.2%.50例2型糖尿病患者血清抵抗素含量为23.2±3.9 ng/mL,明显高于正常值16.0±2.5ng/mL.结果表明该法稳定,灵敏度适于检测人血清抵抗素水平.
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酶联免疫法(ELISA)在检测肝纤维化指标中的应用
目的探讨酶联免疫法(ELISA)在检测血清透明质酸(HA) 、Ⅲ型前胶原(PCⅢ) 、Ⅳ型胶原(CIV)、层粘蛋白(LN)中的应用.方法利用ELISA与放射免疫分析法(RIA)分别检测116例慢性肝炎组、215例正常组和36例肝硬化组的血清HA、PCⅢ、CIV、LN,比较二者的优缺点.结果两种方法结果无差异(p>0.05).结论 ELISA法准确、简便和安全,可代替RIA法.
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大肠癌p53基因突变与血清抗体的相关性研究及意义
目的:研究大肠癌患者血清p53-Ab与p53基因突变及蛋白表达之间的关系及临床意义.方法:运用ELISA法检测34例大肠癌患者及10例健康人血清p53-Ab,同时运用聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和免疫组化(IHC)分别检测p53第5-8外显子突变及蛋白表达状况.结果:大肠癌中血清p53-Ab阳性率为17.6%(6/34),正常对照组血清阴性.p53基因突变率及蛋白表达率分别为52.9%(18/34)和55.9%(19/34),大肠正常粘膜未见p53基因突变及蛋白表达.p53基因突变及蛋白表达与p53-Ab存在及临床病理因素无关(P＞0.05).结论:p53基因突变是参与和影响p53蛋白表达的主要因素,p53蛋白表达可诱导p53-Ab产生,但不是唯一决定因素.检测血清p53-Ab有助于大肠癌的诊断及高危人群普查.
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膨化脱毒处理后蓖麻籽粕中蓖麻毒素的检测
目的 检测膨化脱毒蓖麻籽粕中的残余毒素.方法 蓖麻籽粕经过粉碎、匀浆及离心后得到匀浆上清,应用酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫印迹、金标免疫层析试纸检测蓖麻籽粕在PBST匀浆上清中的蓖麻毒素;应用细胞生长抑制实验测定蓖麻籽粕在生理盐水匀浆上清的细胞毒性.结果 经双夹心ELISA检测蓖麻原粕匀浆含有较高浓度的蓖麻毒素,达到0.25 mg/g;对细胞生长有明显的抑制作用;应用蓖麻毒素检测试纸显示强阳性条带.应用试纸条检测经加热膨化处理后的样品只显示微弱条带.ELISA检测结果表明加热膨化处理后蓖麻籽粕中的毒素含量明显下降,脱毒率达到99%以上.加热膨化处理后样品的匀浆上清在高浓度时对细胞生长仍有一定抑制作用,但与原粕比较细胞毒性明显下降;应用免疫印迹检测蓖麻籽粕结果与ELISA和细胞实验结果一致.结论 本研究将ELISA、免疫印迹和免疫层析试纸相结合,建立了有效检测蓖麻籽粕中残余蓖麻毒素的方法,为蓖麻籽粕脱毒处理样品的质量检测及其应用提供了实验依据.
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双夹心酶联免疫法检测生物样品中的人源化抗体MIL50
目的：建立酶联免疫吸附分析方法（ ELISA ）检测待测样品中的人源化抗体MIL50。方法用原核表达的重组蓖麻毒素（ ricin） A链（ RTA）突变体（ RiVax）为包被抗原，与辣根过氧化物酶（ HRP）标记的羊抗人IgG建立的夹心ELISA，检测生物样品中的人源化抗体MIL50。结果以蓖麻毒素和RiVax包被抗原，ELISA检测MIL50的结果显示，RiVax可与MIL50特异性结合，结合能力不低于全毒素蛋白，可以用于MIL50的定量分析。 RiVax的包被浓度为3 mg/L，对于溶解于含有吐温20（Tween 20）磷酸缓冲液（PBST）中的MIL50的检测灵敏度可达0．030 mg/L；与PBST样品相比较，含有同样浓度MIL50的大鼠血清ELISA的阳性结果明显减弱，不同的大鼠组织匀浆对于MIL50的检测有不同程度的干扰。结论夹心ELISA能够有效地用于人源化蓖麻毒素抗体MIL50的检测分析。
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脱毒蓖麻籽粕中蓖麻毒素的提取及测定
目的 优化双夹心ELISA法检测蓖麻籽粕中蓖麻毒素含量检测方法,并对方法学进行必要的验证.方法 以蓖麻籽粕中蓖麻毒素的含量为指标,对提取溶剂、蓖麻籽粕与溶剂体积比、提取时间、提取过程是否匀浆进行单因素实验,选取佳提取条件.在佳提取条件下对方法的精密度和准确度进行验证.结果 优化出双夹心ELISA法检测蓖麻籽粕中蓖麻毒素的佳提取溶剂为含0.1％ Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST),提取溶剂体积为1∶10(质量/体积),匀浆后提取浸泡时间为1h.该方法特异性高,蓖麻籽粕中杂质成分对测定无干扰.蓖麻毒素在3.91 ～ 250μg/L浓度范围内线性关系良好,日内和日间精密度测定的相对标准偏差(RSD)值分别小于3.2％和11.8％.同一样品重复测定日间RSD值小于5.5％.结论 蓖麻籽粕中的残余蓖麻毒素可采用优化后的实验方法进行有效提取,应用双夹心ELISA方法进行毒素含量的定量分析,该方法为蓖麻籽粕脱毒工艺的确定及脱毒样品的质量控制提供了技术支持.
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双抗体夹心酶联免疫法检测不同样品中的蓖麻毒素
目的 应用酶联免疫吸附分析方法 (ELISA)检测待测样品中的蓖麻毒素.方法 用蛋白 G亲和层析柱纯化蓖麻毒素单克隆抗体(4C13,3D74,5E4和5H6),以3D74及辣根过氧化物酶(HRP)标记的4C13建立的双抗体夹心ELISA对含有蓖麻毒素的多种样品进行检测.结果 抗蓖麻毒素的单克隆抗体经亲和层析纯化后具有较高的蛋白纯度,应用HRP标记的4C13与3D74建立双抗体夹心ELISA,对于溶解于磷酸缓冲液中的蓖麻毒素标准品的检测灵敏度可达2.5 μg*L-1;对于土壤、面粉、牛奶、咸菜汁、雪碧、可乐和腐乳汁中的蓖麻毒素样品检测的灵敏度为2.5～5.0 μg*L-1;与磷酸缓冲液样品相比较,含有相同浓度蓖麻毒素的小鼠和人血清样品ELISA的阳性结果 明显减弱.结论双抗体夹心酶联免疫法能够有效用于含有蓖麻毒素样品的检测分析.
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竞争性ELISA方法检测小鼠血清中的P53蛋白
目的建立动物组织内P53蛋白的免疫检测分析方法,为P53生物药物的代谢分布研究提供检测手段.方法辣根过氧化物酶(HRP)标记抗P53蛋白单克隆抗体3P40,应用标记后的抗体及重组P53蛋白的检测,建立竞争性ELISA检测方法;应用此方法建立血清样品中P53蛋白标准曲线,测定腹腔注射P53后不同时间小鼠血清中P53浓度.结果利用亲和层析纯化的3P40,进行HRP标记,ELISA检测3P40HRP滴度可达1:200000:建立的竞争性ELISA方法可以检测PBST中P53蛋白,灵敏度达30 ng/ml,日内精密度较高,相对标准偏差(RSD)小于5%,体现较好的重复性;分别应用正常小鼠血清、PBST稀释的重组P53蛋白样品进行竞争性ELISA检测,结果显示小鼠血清成分对P53蛋白检测有一定的影响;应用血清制备P53蛋白的标准曲线,检测了腹腔注射P53蛋白后不同时间点小鼠血清样品中的P53蛋白浓度.结论进行了抗P53单克隆抗体3P40的HRP标记,建立了竞争性ELISA方法,可用于P53蛋白药物血药浓度检测.
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鬼臼毒素人工抗原的合成与鉴定
目的合成和鉴定鬼臼毒素人工抗原,以获取具有特异性和高度亲和性的鬼臼毒素多克隆抗体.方法通过酯化反应合成半抗原鬼臼毒素半琥珀酰酯;利用活泼酯法和混合酸酐法偶联成免疫和包被所需的人工抗原;按常规免疫法,从免疫的兔血清中获取高效的抗鬼臼毒素抗体.结果质谱、核磁共振和红外分析表明两种不同方法均成功地合成了半抗原鬼臼毒素半琥珀酰酯.人工抗原的偶联比因载体蛋白和合成方法的不同而有所不同,Hapten-BSA1为88.6,Hapten-BSA2为40.3,Hapten-OVA1为17.8和Hapten-OVA2为54.2.利用兔M4440产生的抗血清建立的ELISA方法对鬼臼毒素的低检测浓度为0.12 μg·mL -1,半数抑制浓度为2.21 μg·mL -1.结论成功地合成了鬼臼毒素人工抗原,并获得了抗鬼臼毒素抗体,为鬼臼毒素免疫分析方法的进一步研究提供了条件.
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2种重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的临床生物等效性评价
目的:比较2种生产基地来源的注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFRII-Fc)在中国健康志愿者体内药动学(pharmacokinetics,PK)特征,并评价二者的相似性.方法:24名男性健康受试者进行随机、开放、双周期两制剂交叉试验,采用经方法学验证的酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测血清中药物浓度.WinNonlin软件非房室模型计算PK参数,并参照生物等效性标准评价受试品(T)与参照品(R)的主要PK参数相似性.结果:本研究建立的测定人血清中TNFRII-Fc浓度的ELISA方法学指数均符合生物制品PK研究的要求.T与R的AUC0-480h分别为(356.00±55.00)与(396.61±69.66)μg·h·mL-1;相对生物利用度F(T/R)为89.90％;Cmax分别为(1.70±0.50)与(1.90±0.50) μg· mL-1;各末端相相关PK参数相似.T的AUC0-480h与Cmax90％置信区间分别落入R的84.10％ ～96.30％与78.50％ ～95.30％范围内.结论:研究涉及剂量下,2种产地来源的TNFRII-Fc的临床PK行为相似,可达生物等效.
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ELISA法测定食蟹猴血清中抗BLyS抗体的抗药抗体
目的:建立测定食蟹猴血清中抗BLyS抗体抗药抗体(ADA)的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法并进行验证,用于测定该药的抗药抗体.方法:在96孔板中包被治疗药物,以捕获食蟹猴血清中的抗药抗体,之后加入生物素标记的治疗药物与被捕获的抗药抗体结合,后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联试剂作为检测试剂.以羊抗人的IgG作为对照品,对食蟹猴血清中的抗药抗体进行半定量.结果:筛选判断阈值信噪比(SNR)为1.158,批内批间精密度小于20％,样品复孔A值变异小于20％,确证判断阈值为38.4％游离药物抑制率.抗BLyS抗体连续给药13周食蟹猴体内产生抗药抗体.结论:成功建立、验证并应用该方法测定了抗BLyS抗体的抗药抗体,为该药申请临床实验报批提供数据支持.
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重组人生长激素在健康猕猴体内的比较药代动力学
目的:比较两种国产重组人生长激素在健康猕猴体内的药代动力学,评价两种药物的相似性.方法:采用交叉自身比较设计,8只健康成年猕猴分别单次皮下注射受试品和参比品0.35 IU· kg-1；采用酶联免疫吸附分析法检测血清中药物浓度,统计矩方法计算各主要药代动力学参数；采用3P97软件参考生物等效性标准对参数进行评价.结果:方法的特异性、灵敏度、精密度和准确度均符合药代动力学研究要求.受试品与参比品的血药浓度-时间曲线基本一致,主要药代动力学参数AUC0～12h分别为(512±102)和( 476±71) μg·h·L-1；AUC0～∞分别为(538 ±115)和(494±77) μg·h·L-1；Cmax分别为(108 ±18)和(96±23)μg·L-1；t1/2分别为(2.8±0.7)和(2.2±0.7) h;MRT分别为(4.2±0.8)和(4.0±0.8)h; CLs/Fsc分别为(0.047 ±0.014)和(0.060 ±0.013) L·h-1·kg-1；Vd/Fsc分别为(0.194±0.04)和(0.24 ±0.06) L·kg-1.以AUC0～∞计算,受试品与参比品比较,相对生物利用度F为(109±15)％.受试品相对于参比品的生物等效性用AUC0～12 h,AUC0～∞和Cmax的90％可信区间评价分别为89.2％～114.3％,87.4％～112.7％和98.5％～124.4％,均符合生物等效性判断标准.结论:受试品与参比品药代动力学参数评价结果满足生物等效接受标准；两种重组人生长激素在猕猴体内呈现相同的药代动力学特征.
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ELISA法测定恒河猴血清中艾塞那肽衍生物的抗药抗体
目的:建立测定恒河猴血清中艾塞那肽衍生物抗药抗体(ADA)的ELISA方法并进行验证,用于测定该药的抗药抗体.方法:将药物包被在96孔板中作为捕获试剂,捕获猴血清样本中的抗药抗体,羊抗猴IgG辣根过氧化物酶偶联二抗作为检测试剂与被捕获的抗药抗体结合.阴性对照孔加入的血清样本为经筛选的空白基质,而阳性对照孔直接包被经筛选的空白恒河猴血清,其中的IgG被包被于板孔中,其余步骤与阴性对照孔一致.方法建立后进行筛选判断阈值,确证判断阈值,方法精密度验证.结果:筛选判断阈值为0.1,方法批内批间精密度小于25％,样品复孔A值变异小于15％,确证判断阈值为84％游离药物抑制率.艾塞那肽衍生物连续给药13周后在恒河猴体内产生抗药抗体,抗体阳性率与对照药相当.结论:成功建立及验证该方法,并用于艾塞那肽衍生物长期毒性研究伴随免疫原性测定中,成为该药申请临床试验的报批资料之一.
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晚期糖基化交联产物裂解剂酶联免疫吸附测定筛选方法的建立
目的建立一种快速、体外筛选晚期糖基化终产物(AGE)交联结构裂解剂的方法.方法以牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖孵育形成AGE-BSA,并与包被于96孔酶标板上的大鼠尾胶原蛋白交联制备AGE-BSA-胶原交联结构,药物作用一定时间后,采用以抗BSA为抗体的ELISA方法检测BSA残留量,以此评价裂解剂的裂解强度.并对ELISA全程条件进行了优化.结果 BSA与葡萄糖孵育3～4个月后,在Ex/Em(395/460 nm)下出现特异性荧光,SDS电泳显示68.0 ku的BSA已转化为分子量大于68.0 ku蛋白质,表明已形成AGE-BSA;AGE-BSA可与鼠尾胶原蛋白形成特异性的交联结构,强特异性结合的包被量为每孔0.01～0.1 μg.理想的封闭液为Pierce公司的SuperBlock封闭缓冲液.用新建立的ELISA方法对先导化合物苯基-4,5-二甲基噻唑氯嗡盐(ALT-711)及新合成10种裂解剂进行了体外裂解效应的评价,ALT-711结果与文献报道基本一致;本方法筛选的结果与高效液相以小分子二羰基化合物为底物的筛选方法结果趋势一致.结论此方法可用于体外筛选AGE交联裂解化合物,并具有高通量的特点.
关键词： 晚期糖基化交联产物裂解剂 药物筛选 酶联免疫吸附分析
