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抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达
目的 构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达.方法 采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和PcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达.通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性.结果 抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120 h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28 ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合.结论 已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达.
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抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因在CHO细胞中的表达
目的构建抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因,并在CHO细胞中表达.方法采用RT-PCR及RACE技术从鼠杂交瘤细胞克隆免疫球蛋白可变区基因,与人免疫球蛋白恒区基因拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因,转染CHO细胞并测定其表达量.结果构建的嵌合抗体基因在CHO细胞中的初始表达量为0.71μg/ml,亚克隆后表达量达0.95μg/ml.结论已成功构建抗人TNF-α嵌合抗体基因,并在CHO细胞中得到了高效表达.
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抗人CD4嵌合抗体的稳定表达及鉴定
目的 构建抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,并对表达产物进行鉴定.方法 采用脂质体法将抗人CD4嵌合抗体质粒pHDC4稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压筛选抗人CD4嵌合抗体稳定表达株,经细胞工厂扩大培养.收集培养上清,经Protein A亲和层析纯化目的抗体,激光共聚焦显微镜观察抗体基因在细胞内的表达,并分别进行质谱分析、蛋白质N-末端测序和平衡解离常数(KD)的测定.结果 构建的抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株的抗体表达水平为4.29 ～ 10.52 μg/ml;BCA测得纯化回收后的抗体表达水平为12.68 mg/L;激光共聚焦检测显示,抗CD4嵌合抗体稳定表达细胞株可稳定表达人的恒定区和鼠的可变区；质谱分析表明,其含有鼠源性和人源性成分；蛋白质N-末端氨基酸测序表明,其轻链与亲本抗体N-末端氨基酸序列完全一致；其KD为2.67×10-9M.结论 成功构建了抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,其表达的抗人CD4嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合特异性和亲和力.
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高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析
目的 建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株.方法 将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量.用ELISA、Western blot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性.结果 获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4 d后工程抗体的表达量约80 mg/L.所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L.结论 已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景.
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抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达
目的 在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中表达抗人T淋巴细胞CDM人-鼠嵌合抗体.方法 真核表达质粒PAG4622+CD4VL和PAH4604+CD4VH经酶切和序列测定后,采用电穿孔转染技术将二者共转染SP2/0细胞,经组胺醇和霉酚酸联合筛选阳性克隆,通过ELISA、流式细胞术、RT-PCR和DNA测序的方法进行初步鉴定.结果 真核表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确.获得2株分泌抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的阳性SP2/0细胞克隆0925CASP2/0和1107CASP2/0,嵌合抗体表达量为0.5～2 ng/ml.结论 已成功地在SP2/0细胞中表达了抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体,为该抗体在其他真核细胞中的高效表达及临床应用奠定了基础.
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抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达
目的 构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定.方法 分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人IgGl重链恒定区基因连接,VL基因与人IgG1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入pOptiVECTM-TOPO(R) TA载体,轻链基因连入pcDNATM3.3-TOPO(R) TA载体,构建重链表达质粒pOptiVEC-H和轻链表达质粒pcDNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经MabSelectSure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数.结果 鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长.嵌合表达载体pOptiVEC-H和pcDNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确.经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml.纯化的嵌合抗体纯度达99％以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L.结论 成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础.
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人鼠嵌合抗体的基因构建
为了克服鼠单克隆抗体在人体治疗中出现的问题,经典的基因工程抗体技术将人源抗体恒定区替代鼠抗体的恒定区,即构建人鼠嵌合抗体.嵌合抗体不仅保留了亲本抗体的特异性和亲和力,大大降低了人抗鼠抗体(HAMA)反应,而且可表现出不同的生物学功能和半衰期.本文就嵌合抗体鼠抗体可变区基因的克隆、人抗体恒定区基因的钓取、鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因的拼接及表达载体和宿主细胞的构建作一综述.
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抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性
目的 构建抗人细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)嵌合抗体的真核表达质粒,在CHO-dhfr-细胞中进行表达,并检测其生物学活性.方法 采用RT-PCR法从特异性分泌抗人ICAM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中扩增抗体VH和VL基因,从人淋巴细胞RNA中扩增人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列,再通过重叠延伸PCR连接鼠源性可变区基因片段与人源性恒定区基因片段,获得人-鼠嵌合抗体基因;将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体,构建嵌合抗体真核表达质粒;将质粒在脂质体LipofectAMINE介导下转染CHO-dhfr细胞进行表达,表达的嵌合抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,紫外分光光度法测定抗体浓度,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性,并进行还原性SDS-PAGE分析、Western blot分析及抑制细胞间黏附活性分析.结果 嵌合抗体真核表达质粒pIRES-anti-ICAM-1经双酶切鉴定构建正确;嵌合抗体在真核细胞CHO-dhfr-中高效表达,培养上清中表达量可达0.5 mg/L;纯化的嵌合抗体经10％还原性SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约为25 000的IgG轻链和50 000的IgG重链,相对分子质量约25 000的蛋白可被羊抗人IgG κ链所识别,而相对分子质量约50 000的蛋白可被羊抗人IgG γ链所识别;纯化的嵌合抗体可与羊抗人κ链或羊抗人IgG多抗呈强阳性反应,可与人ICAM-1抗原特异结合;该嵌和抗体具有良好的抑制内皮细胞与单核细胞黏附的活性.结论 成功制备了抗人ICAM-1嵌合抗体,并在真核细胞中实现高表达,该抗体减少了鼠源性成分,降低了其免疫原性,为ICAM-1相关的炎性疾病的抗体治疗奠定了基础.
关键词： 抗人细胞间粘附分子-1 嵌合抗体 真核细胞 基因表达 生物学活性 -
人源化抗体研制策略分析及应用研究
鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所替代,人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代.本文介绍并比较分析了几种制备人源化抗体的策略和抗体表达系统,并对其临床应用进行了展望.
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单克隆抗体治疗制剂研究与应用
文本讨论了降低鼠单克隆抗体免疫原性的方法,采用嵌合抗体技术和互补决定区(CDR)稼接技术能使鼠源抗体部分人源化.此外,本文还介绍了治疗性单克隆抗体的研究现状.
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单克隆抗体人源化研究进展
目前单克隆抗体大多数是鼠源的，在临床重复给药的治疗过程中有许多副作用。由于技术限制，好的解决方法就是研制人源化抗体，以代替鼠源单抗用于临床。本文概述了几种常用的异源单抗人源化的方法。
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嵌合抗体研究进展
单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要作用,但是在临床治疗中人抗鼠抗体反应的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到了很大限制.随着分子生物学、分子免疫学技术的飞速发展,抗体技术已发展到第三代抗体——基因工程抗体阶段,可利用基因工程技术对鼠源性抗体进行改造,保留或增强天然抗体的特异性和主要生物学活性,同时减少鼠源成分,以避免鼠源性单克隆抗体在临床应用方面的缺陷.此文就基因工程抗体中的重要组成部分嵌合抗体的研究进展做一综述.
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抗CTLA-4嵌合抗体的制备及生物学活性鉴定
制备新型抗CTLA-4人鼠嵌合抗体并进行活性鉴定.通过杂交瘤技术获得高亲和力小鼠抗人CTLA-4单克隆抗体22G11和16C11;利用分子克隆技术将鼠源抗体可变区基因与人源抗体恒定区拼接后,终通过CHO-K1工程株细胞表达高亲和力抗CTLA-4嵌合抗体.经SDS-PAGE电泳显示终获得了纯度高于90％的CTLA-4嵌合抗体c22G11和c16C11,抗原结合活性结果表明两株嵌合抗体都能很好地与Jurkat细胞结合,竞争抑制实验表明它们都能与各自对应的鼠源抗体竞争.据此,本实验获得了两株抗人CTLA-4胞外区的高亲和力和特异性嵌合抗体.
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抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达
从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因.通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列.采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgGl的CH基因、Ck链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1.转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%.既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1).收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量.从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L.经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%.将嵌合抗体(终浓度为5 μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05).本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值.
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两种Icon嵌合抗体在肿瘤靶向免疫治疗中的应用
由于免疫学研究的深入以及抗体技术的开展,嵌合抗体已经成为免疫治疗中的热点.本综述所及两种结构相似的嵌合抗体G71-1 Icon和因子ⅦIcon.G71-1 Icon能抑制黑色素瘤的肿瘤细胞生长和转移;因子ⅦIcon能破坏多种实体肿瘤所形成的新生血管.黑色素瘤动物实验表明2种Icon肿瘤内注射不仅可以使注射部位肿瘤生长受到抑制,而且还可以对远处转移的病灶产生抑制作用;并且对正常的组织和器官不产生损害.经过动物实验验证,2种Icon安全并且有效为治疗肿瘤以及抗转移提供了一种新的思路.
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chTNT-3-空间稳定脂质体的制备及理化性质考察
将人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗(chTNT-3)共价连接到多柔比星脂质体表面,制得的chTNT-3-空间稳定脂质体粒径分布为(123.1±28.4)nm,多柔比星包封率大于98%.初步稳定性考察表明,在低温(4℃)贮存7d,制品平均粒径及分布变化小,药物泄漏少于3%,免疫活性保持不变,理化性质尚较稳定.
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抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达
目的 构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体.方法 采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:2F5)中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列.分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5.转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养.采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况.结果 抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合.结论 抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础.
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人-鼠嵌合抗人组织蛋白酶B抗体体外抑制组织蛋白酶B活性的试验
目的体外试验人-鼠嵌合抗人组织蛋白酶B(抗Cat B)抗体对Cat B的抑制作用.方法培养1株分泌人-鼠嵌合抗人Cat B抗体细胞,收集细胞培养上清,分离纯化人-鼠嵌合抗人Cat B抗体,用于体外抑制Cat B活性试验.结果该抗体在体外能抑制Cat B活性.结论抗Cat B抗体能特异结合Cat B并抑制其酶活性,将可能用于Cat B过度表达的癌症治疗.
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抗CEA人/鼠嵌合抗体rch24在裸鼠人结肠癌模型中的放射免疫显像
笔者探讨125Ⅰ标记抗癌胚抗原(CEA)人/鼠嵌合抗体rch24在裸鼠人结肠癌模型中放射免疫显像(RⅡ)及其用于结肠癌定位诊断及导向治疗的可行性,现报道如下.
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抗ErbB2嵌合抗体chA21对SKBR3细胞的增殖抑制以及对PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的影响
目的 检测抗ErbB2嵌合抗体chA21对高表达ErbB2乳腺癌细胞SKBR3的增殖抑制作用,并分析抗体对细胞膜上ErbB2分布以及对细胞PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的影响,探讨chA21的抑癌机制.方法 采用MTT检测chA21对SKBR3的增殖抑制作用,流式细胞术检测经chA21处理后细胞膜上ErbB2抗原的分布变化,Western blot检测抗体作用后对细胞PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的影响.结果 chA21可抑制SKBR3细胞的增殖,其作用呈剂量和时间依赖性.抗体作用后可下调细胞膜上ErbB2含量,并不同程度下调细胞的PI3K/Akt和Erk1/2的活化水平.结论 chA21可抑制SKBR3细胞增殖,可能通过下调细胞膜上ErbB2分布而减少其介导的PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的活化来实现的.
