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血清和胃液中多种肿瘤标志物检测在胃癌中的临床价值
目的:探讨血清和胃液中多种肿瘤标志物检测在胃癌中的临床价值.方法:选取2008年12月～2009年12月于本院进行治疗的35例胃癌患者为A组,同时选取同期的35例良性胃病患者为B组和35名健康人为C组,后将3组人员的血清及胃液人肿瘤坏死因子α(TNF-α)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)和糖类抗原724(CA724)中的水平进行检测及比较.结果:经研究比较发现,A组的血清及胃液TNF-α、CEA、CA199和CA724水平明显高于B组及C组,P＜0.05或P＜0.01,差异均有统计学意义.且晚期胃癌患者的血清及胃液TNF-α、CEA、CA199和CA724水平明显高于早期患者,胃液明显高于血清,P均＜0.05.结论:在胃癌的诊断中采用血清及胃液TNF-α、CEA、CA199和CA724联合检测对于提高检测率有重要作用.
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体外培养APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响
背景:积极探索结肠癌相关基因及抑癌基因已成为新的研究热点,人肿瘤坏死因子α是一个重要的促炎因子和免疫调节因子,对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效.目的:观察体外培养海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响.方法:采用前期建立的制备方法,用APA微囊分别包裹人肿瘤坏死因子α/293细胞,APA微囊化0/293细胞.取对数生长期结肠癌(Lovo)细胞,配制成所需浓度的细胞悬液,接种24孔板培养,分别加入低、中、高剂量稳定转染的APA微囊化肿瘤坏死因子α/293,即分为5个实验组,APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组为APA微囊化0/293细胞组,阳性组加入肿瘤坏死因子α,MTT法检测490 nm吸光度;通过对人肿瘤细胞增殖抑制实验,观察对结肠癌细胞(Lovo)增殖的抑制作用.结果与结论:体外培养中,加入APA微囊化0/293细胞组对结肠癌细胞增殖无抑制作用;而APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞中、高剂量组和阳性组,在24,48,72 h的A值低于APA微囊化0/293细胞组(P < 0.05),提示APA微囊化人肿瘤坏死因子α/293细胞所分泌肿瘤坏死因子α对结肠癌细胞有增殖抑制效应,均呈现出良好的数量依赖关系.
关键词： 人肿瘤坏死因子α 微囊 结肠癌细胞 人胚胎肾细胞HEK-293 增殖 -
PSNAV2.0-TNFα重组质粒的构建及其在体外的表达
目的:在前期微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,构建分泌型人肿瘤坏死因子α的真核表达载体PSNAV2.0-TNFα重组质粒,并鉴定其蛋白的体外瞬时表达,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗和改善疾病奠定基础.方法:实验于2006-06/2007-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学实验室完成.①以含有人肿瘤坏死因子αcDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得人肿瘤坏死因子α基因片段;将其定向插入真核表达载体PSNAV2.0中,获得重组质粒PSNAV2.0-TNFα.采用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒.②利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾细胞HEK-293细胞中,构建可持续分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测转染细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子蛋白的体外瞬时表达.结果:①通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在HEK-293中插入片段正确.②采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有人肿瘤坏死因子α蛋白,Mr17 000.结论:成功构建了重组质粒PSNAV2.0-TNFα真核表达载体,转染HEK-293细胞后可有效分泌人肿瘤坏死因子α蛋白,并能分泌到细胞外.
关键词： 人肿瘤坏死因子α 真核表达载体 人胚胎肾细胞HEK-293 -
hTNFα寡聚组氨酸融合蛋白的表达
目的 利用大肠杆菌表达系统对人肿瘤坏死因子(hTNFα)的寡聚组氨酸(6×His)融合蛋白进行表达和纯化研究。方法 采用大肠杆菌表达系统的表达载体pET-28a(+)和pET-22b(+)表达了hTNFα的6×His融合蛋白，其6×His分别位于融合蛋白的N和C端，并利用寡聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质，经Ni2+-IDA Sepharose 6B亲和柱对表达产物进行了纯化。 结果 其表达量分别为菌体总蛋白的45%和8%。前者在胞内以不溶性包涵体存在，未对表达产物作进一步纯化；后者在胞质空间以可溶性存在，经亲和纯化的hTNFα-6×His纯度可达90%以上，得率为0.4mg/100ml,并对L929细胞具有杀伤的功能，其活力为5.42×104U/mg。 结论 表达产物经纯化后具有细胞毒的活性。
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重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究
构建有利于人肿瘤坏死因子α(TNF-α)大量表达及有效纯化的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.通过密码子优化构建表达质粒pET28-TNF,并将其转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达并通过两轮镍柱亲和纯化获得高纯度重组人TNF-α(rhTNF-α)蛋白.应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性.成功构建了重组人TNF-α原核表达载体,并通过表达纯化获得了纯度＞95％,具有生物活性(LD50＜ 10 ng/mL)的rhTNF-α蛋白.
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分泌肿瘤坏死因子的基因工程细胞对HepG2细胞的抑制作用
目的 自行建立分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,将其与肝癌细胞共培养,观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞表达的情况及对人肝癌细胞的抑制作用.方法 (1)建立可稳定分泌人肿瘤坏死因子α/293细胞;采用RT-PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪等技术检测人肿瘤坏死因子表达和分泌;(2)观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞对人肝癌细胞的抑制作用,于不同的时间点,用MTT法检测490 nm下的吸光度值.结果 RT-PCR、Western blot和ELISA等技术检测表明hTNFα/293细胞组和TNFα阳性组对共培养的HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系.结论 提示TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外;体外培养的人肿瘤坏死因子基因的工程细胞,所分泌肿瘤坏死因子α对人肝癌细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系.
关键词： 人肝癌细胞HepG2 人肿瘤坏死因子α 人胚胎肾细胞-293 -
SA-TNF-α融合蛋白高效表达、纯化及复性研究
目的 研究链亲和素标记的人肿瘤坏死因子α(SA-TNF-α)融合蛋白的纯化、复性方法 ,并研究其生物学功能.方法 在大肠杆菌中表达SA-TNF-α融合蛋白,对表达的SA-TNF-α融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,分别在尿素体系和盐酸胍体系中复性,Western blot对其进行鉴定.MTT法检测SA-TNF-α融合蛋白对L929细胞的杀伤活性,流式细胞仪分析SA-TNF-α融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰率.结果 SA-TNF-α融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的目标蛋白占菌体蛋白30%以上,镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱纯化的SA-TNF-α融合蛋白纯度达到95.7%,经过两种体系复性形成的SA-TNF-α融合蛋白的二聚体和多聚体均具有双功能活性:既对L929细胞有杀伤活性又能锚定修饰生物素化的MB49细胞,锚定修饰率大于90%.结论 初步建立了SA-TNF-α融合蛋白制备工艺,SA- TNF-α二聚体和多聚体均具有双功能活性,SA-TNF-α融合蛋白的研制有望为肿瘤的治疗提供新的治疗方法 及新型药物.
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两种炎症性关节炎小鼠模型的比较
目的 通过比较胶原诱导(CIA)和人肿瘤坏死因子α转基因(hTNFα-Tg)小鼠关节炎模型的临床特征,为炎症性关节炎疾病的致病机理和药物筛选研究提供合适的模式动物.方法 分别采用鸡Ⅱ型胶原注射DBA/1小鼠建立经典的类风湿性关节炎(RA)模型,利用人肿瘤坏死因子α注射FVB小鼠建立关节炎转基因小鼠模型,通过关节表观特征观察、关节炎指数分析和病理观察评分对炎症性关节炎模型进行评价.结果 在炎症细胞浸润方面,CIA模型主要有中性粒细胞浸润,hTNFα-Tg模型主要是淋巴细胞浸润,且差异有统计学意义(P<0.05);在细胞增殖方面,两种模型都显示滑膜细胞的增生,与CIA模型相比,hTNFα-Tg模型滑膜增生为严重,差异有统计学意义(P<0.05);在骨侵蚀方面,两种模型都显示增生滑膜对骨的侵蚀,两种模型比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 两种关节炎模型均在一定程度上模拟人关节炎的临床症状,但也存在着差异.CIA模型造模时间长,能较好模拟RA临床特征;hTNFα-Tg模型属于自发型,表现为滑膜不断增生,符合RA晚期临床特征.
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含凝血酶切点的 hTNFα -hPgnK5的原核表达及活性鉴定
目的在原核细胞中表达融合蛋白 hTNFα -hPgnK5并鉴定其活性。方法构建 hTNFα -hPgnK5基因的表达载体，并在大肠杆菌 DH5α中进行表达。以 MTT法测定该融合蛋白体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性。结果成功地构建了 hTNFα -hPgnK5表达载体并获得表达。免疫印迹分析表明，该融合蛋白具有 hPgnK5的免疫活性。体外实验表明 ,该融合蛋白具有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性。结论 hPgnK5蛋白可与 hTNFα可共同表达，表达产物可抑制肿瘤细胞和血管内皮细增殖。
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重组人肿瘤坏死因子(hTNF-α)在大肠埃希菌[E.coli BL21(DE3)]中表达条件的优化
目的 构建人肿瘤坏死因子(hTNF-α)表达质粒,并对其进行鉴定,优化hTNF-α蛋白表达条件使之在大肠埃希菌中实现高效表达.方法 应用PCR扩增技术获得hTNF-α基因片段并进行相应的鉴定,将鉴定后的hTNF-α基因克隆到pET24a载体中,获得pET24a-hTNF-α表达质粒.将此质粒转化入大肠埃希菌BL21 (DE3)中,并对其表达条件进行优化.结果 成功构建了pET24a-hTNF-α质粒,PCR和酶切技术进行鉴定,结果显示与目的片段一致.将此质粒转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,得到佳表达条件为:M9+LB培养基,37℃,0.5 mmol/LIPTG,pH值=7.5,诱导时间为5h.优化后的菌体干重增高了2.56倍,hTNF-α产率增加3.68倍,hTNF-α表达率从9.38％增加到32.74％,增高了3.49倍.结论 优化了pET24a-hTNF-α质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达条件,使hTNF-α蛋白得到高效表达.
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分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立
目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.
关键词： 人肿瘤坏死因子α 真核表达载体 人胚胎肾细胞HEK-293 细胞系 -
人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析
目的 在大肠杆菌中表达抗人TNF-α单链抗体(ScFv)，并分析 它的结合活性和中和活性. 方法 在获 得抗人TNF-α E6ScFv的基础上，用热诱导载体pBV220在大肠杆菌中表达E6ScFv蛋白. ELIS A测定抗体的结合活性，实时BIA技术确定亲和常数，L929 细胞毒试验分析其中和活性. 结果 克隆了抗人TNF-α E6ScFv基因的热 诱导载体pBV220在大 肠杆菌中，经42℃热诱导，得到了相对分子质量(Mr)约为27 000的重组蛋白质，表达 量占菌体 总蛋白的18%. 对在大肠杆菌中表达的E6ScFv进行了复性和亲和层析纯化，并进一步证实： ①E6ScFv具有与hTNF-α结合的活性，其结合表位与亲本抗E6单克隆抗体(mAb)相同；②E6S cFv与hTNF-α的亲和常数为3.71×104 M-1；③E6ScFv具有中和hTNF-α细胞毒作 用的活性. 结论 以上结果有助于ScFv拮抗TNF-α的治疗.
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人源天然抗TNF-αScFv抗体的筛选及性质分析
目的 以人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor-α,human TNF-α)为靶抗原,从构建好的人源天然单链抗体(single-chain antibody fragment,ScFv)噬菌体抗体库中筛选对应的ScFv抗体,验证其中和活性后测定动力学常数(kineticdissociation,KD).方法 以TNF-α梯度稀释后包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行3轮吸附-洗脱-扩增的富集筛选,制备TNF-α单克隆噬菌体抗体颗粒,经ELISA试验筛选阳性克隆后测序并分析;将正确的阳性抗体序列亚克隆到pET-26b表达载体上,原核表达后用Ni Sepharose 6 Fast Flow介质进行纯化;用MTT比色法对筛选的ScFv进行中和活性验证,并测定其中和抗体的KD.结果 通过3轮筛选共得到18个正确的抗体氨基酸序列,对其原核表达及纯化后得到的6株可溶性表达的抗TNF-α ScFv进行中和活性验证,并对其中有中和活性的4株ScFv抗体测定KD.结论 从人源天然ScFv噬菌体抗体库中成功地筛选出4株抗人TNF-α的ScFv中和抗体,其中1株ScFv抗体的KD为4.80×10-8,细胞毒中和率达到48.9％,达到了药用级抗人TNF-α中和抗体的研发要求,为全分子抗体药物的构建及稳定细胞株的筛选奠定了一定的基础.
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全人源化抗人TNF-α单克隆抗体毛细管区带电泳鉴别方法的建立及验证
目的 建立及验证用于全人源化抗人TNF-α(Tumor necrosis factor-α)单克隆抗体(简称抗人TNF-α单抗)鉴别的毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis,CZE)方法.方法 采用DB-1毛细管,以样品检测分离度、迁移时间、电流及峰形为判断标准,筛选CZE过程中的各种参数(缓冲液pH、ε-氨基乙酸浓度、乙酸钠浓度、羟丙基纤维素浓度、样品稀释剂、进样时间及运行电压等),建立CZE方法,并对方法的专属性、精密度、中间精密度进行验证.结果 建立的CZE方法参数条件为:缓冲液pH为5.0,EACA浓度为300 mmol/L,乙酸钠浓度为20 mmol/L,HPMC质量分数为0.05％,用50 mmol/L Tris稀释样品,进样时间为15 s,运行电压为20 kV.样品制备重复性主峰迁移时间RSD为0.459％,中间精密度RSD为1.145％.结论 CZE方法分离度高、专属性强、重复性和精密度好、简单快速,可作为全人源化抗人TNF-α单抗的鉴别方法.
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构建hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌细胞增殖影响的实验研究
目的通过体外实验研究观察稳定转染hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌( LOVO)细胞生长增殖影响。方法采用RT-PCR和ELISA检测稳定转染hTNF-α/293基因细胞和Hek-293细胞mRNA和蛋白表达水平。观察体外培养中,hTNF-α/293基因细胞与LOVO细胞共同培养,于不同的时间点,采用噻唑蓝MTT法检测LOVO肿瘤细胞增殖的活性。结果重组质粒转染Hek-293细胞后,Western blot检测到了hTNFα蛋白体外表达,检测表明hTNFα/293细胞组和hTNFα阳性组对共培养的LOVO细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示稳定转染hTNF-α/293对LOVO细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。由于TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。
