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成人重组酵母乙型肝炎疫苗免疫效果的研究
目前,接种乙型肝炎(乙肝)疫苗是保护易感人群唯一有效的措施,而对其免疫效果、持续时间、加强免疫以及免疫无应答等问题,成人报道较少.为此,我们在某高校连续2年开展了重组酵母乙肝疫苗免疫效果的现况研究.
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重组酵母筛选法评估黑种草中酚性化合物的雌激素活性
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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不同剂量乙肝疫苗免疫效果对比
目前,国内外许多国家已对军队实施重组酵母乙肝疫苗预防接种,但推荐的标准剂量有较大差别,按0、1、6个月免疫程序,国内普遍采用3次5μg方案[1],欧美国家则采用3次20μg方案[2].
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氮离子注入介导麻黄基因组DNA转化酵母菌
目的 以麻黄碱为目标产物,探讨氮离子(N+)注入介导麻黄基因组DNA在酵母菌中的转化.方法 通过N+注入介导蓝麻黄基因组DNA分别在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和异常汉逊酵母Hamenula anomala中随机转化,转化后的酵母菌经BTB指示性辅助筛选、斜面传代和液体培养后,用铜铬盐定性检识和RP-HPLC方法,检测重组酵母菌胞外和胞内麻黄碱的量.结果 获得了遗传稳定的以葡萄糖为碳源、NaNO3为氮源生物合成麻黄碱和(或)伪麻黄碱的重组酵母菌9株.液体培养72 h,RP-HPLC测试胞外麻黄碱和伪麻黄碱的高量分别为18.85和2.88 mg/L;胞内麻黄碱和伪麻黄碱高量分别为4.29和22.16 mg/g干细胞.结论 采用离子注入介导麻黄基因组DNA大分子转化技术,通过适当的筛选方法,可获得易于人工培养的产生麻黄碱等次生代谢产物的微生物工程菌株.
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391 用重组酵母筛选模型评价黑种草中酚类成分的雌激素样活性
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潍坊市中小学生重组酵母乙型肝炎疫苗接种效果
目的 评价重组酵母乙型肝炎疫苗(以下称乙肝疫苗)在潍坊市中小学生中大规模接种后的效果.方法 采用随机整群抽样法,选择奎文区中小学各1所.小学1-6年级和中学初一到高三的6-18岁1829名学生,接种重组酵母乙肝疫苗.1年后,采用ELISA检测血清中HBsAg、抗-HBc、抗-HBs.结果 乙肝疫苗接种前后乙肝病毒标志物(HBVM)阳性率差异有统计学意义(x2=236.66,P<0.01);HBVM中.接种后抗-HBs阳性率显著高于接种前(x2=205.42,P<0.01);接种前后HBsAg总感染率、抗-HBc总感染率差异无统计学意义.结论 中小学生大规模接种的效果较好,低年龄组人群应为乙肝疫苗大规模接种的优选对象.
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北京市东城区不同人群接种乙肝疫苗免疫效果评价
北京市自1990年开始逐步将新生儿乙肝疫苗接种纳入计划免疫管理,同时对托幼儿和小学生进行接种;1994~1997年连续几年对青少年实施普种.以后又逐步对宾馆、机关等单位的成人开展乙肝疫苗的接种.并从1996年底东城区开始使用重组酵母基因工程乙肝疫苗.本课题通过对东城区不同人群进行血清流行病学调查,对其接种乙肝疫苗的效果进行评价,为制定下一步乙肝免疫策略,如青少年加强免疫时间、成人接种乙肝疫苗等提供科学依据.
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adr亚型HBsAg冻干实验参考品的制备与检测
目的 制备用于检测重组酵母表达的adr亚型HBsAg含量的实验参考品.方法 重组酵母表达的adr亚型HBsAg溶液经纯化后,经3家实验室联合标定蛋白含量,准确稀释并加入保护剂,使抗原终含量为10 μg/ml,分装安瓿后,冷冻干燥熔封,制备成adr亚型实验参考品.再由不同实验室用不同试剂和不同方法,以联合标定的蛋白含量为定量标准,分别验证冻干参考品中adr亚型HBsAg含量及37 ℃放置不同时间的稳定性.并以adw亚型HBsAg标准作为定量标准,检测adr亚型参考品中HBsAg含量.结果 所制备的adr亚型冻干参考品分装准确均匀;以联合标定蛋白含量为标准,不同实验室分别以珠式EIA法和RIA法所测的adr亚型冻干参考品HBsAg含量与目标含量相近,各支参考品间差异小;adr亚型冻干实验参考品37 ℃放置2~10周后质量稳定.以adw亚型HBsAg参考品为定量标准,所测定adr亚型冻干参考品HBsAg含量,比实际含量约高出0.6倍.结论 冻于adr亚型HBsAg实验参考品可用于重组酵母表达adr亚型HBsAg的定量检测.不同亚型HBsAg检测需用各自亚型的参考品作为定量标准.
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重组酵母乙肝疫苗接种后抗体水平分析
乙肝疫苗是预防并终控制乙型病毒性肝炎(乙肝)有效的手段.我国以往乙肝基因工程疫苗的研究大部分单纯以儿童或单纯以成人研究为主,为了获得乙肝基因工程疫苗的免疫效果和安全性,我们采用重组酵母乙肝疫苗对869例6~60岁的对象进行了免疫效果观察,现将结果报告如下.
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复种重组酵母乙型肝炎疫苗效果观察
为了解我校新生乙肝病毒携带状况,十多年来,我们每年都对新生进行乙肝标志物(两对半)检测,感染率为8.8%~13.1%,且有逐年增高的趋势.近几年有所稳定.
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HCMV-UL138 CTL表位肽重组酵母菌的构建及其免疫效应
目的:以乙肝病毒表面抗原为载体,制备含人巨细胞病毒(HCMV)-UL138 CTL表位肽的重组酵母菌并分析其免疫效应。方法:根据蛋白质数据库获得HCMV-UL138氨基酸序列,综合应用SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind方法筛选富含CTL表位的UL138多肽,插入到乙肝表面抗原前S2(PreS2)1-9区末端再与HBsAg 序列连接,在不改变氨基酸密码的前提下,根据酵母偏爱密码子优化序列,进行全序列合成,克隆入pPIC3.5K酵母载体,构建pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组质粒经Bgl II处理线性化后,电转化至GS115菌株中,构建PreS2-HBsAg-UL13815-27重组酵母,阳性整合菌株经甲醇诱导后,通过Western blot及ELISA方法鉴定目的蛋白表达。鉴定的重组酵母菌经灭活后,全菌体皮下免疫BALB/c小鼠,通过ELISA法检测HBsAg特异性血清IgG抗体;UL13815-27 CTL表位肽(VMLVLIVAILCYL)刺激免疫小鼠的脾细胞,通过检测IFN-γ表达分析诱导产生的CTL反应。结果:PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组酵母经甲醇诱导后,酵母裂解液中可检测到HBsAg特异性抗体识别的、分子量约33 kD目的蛋白。表达PreS2-HBsAg-UL13815-27灭活全菌体免疫小鼠后,可检测到HBsAg特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经UL13815-27 CTL表位肽刺激,IFN-γ表达水平比对照组明显升高。结论:重组酵母全菌体成功表达了PreS2-HBsAg-UL13815-27重组蛋白,且重组酵母菌全菌体免疫小鼠可诱导产生UL13815-27特异性的细胞免疫。
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重组酵母乙型肝炎疫苗无(或弱)应答者复种远期效果观察
目的 探讨重组酵母乙肝疫苗无(或弱)应答者复种远期效果.方法 严格筛选无(或弱)应答者40名,分肌肉和皮内接种,用3针加倍剂量(每次10 μg或20 μg),以80名同期筛检人群正常应答者作对照,完成30个月随访观察.结果 无(或弱)应答者复种后产生抗体应答;第30个月,肌肉和皮内组仍有64.7%和34.8%维持抗体阳性.但无(或弱)应答者抗-HBs阳性率和抗体阳性者的抗体几何平均滴度(GMT)均明显低于正常应答者(P<0.01).无(或弱)应答者HBV累积感染率(单项抗-HBc阳性)为25.0%(肌肉组17.6%,皮内组30.4%),显著高于正常应答者2.6%(P<0.01).结论 肌肉接种好于皮内接种.无(或弱)应答者复种确实能起到改善应答并在一个相对较长时间里维持抗体水平的作用.
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大学生接种重组乙肝疫苗后不同时间的免疫效果观察
目的:探讨我校学生对乙肝疫苗的免疫应答状况.方法:对1999~2001年在入学时已全程接种了5 μg/次重组酵母乙肝疫苗的912名学生,观察其免疫后1、2、3年血清的抗-HBs阳转率,并对检测HBV 5项指标全部阴性的学生加强接种一针10 μg重组酵母乙肝疫苗,1个月后再检测抗-HBs.结果:全程接种乙肝疫苗1年后检测抗-HBs阳转率为78.92%,2年后是69.20%,3年后是58.60%.全程免疫3年后抗-HBs阳转率低,与全程免疫后1、2年相比,差异有统计学意义(P<0.05).加强接种一针10 μg乙肝疫苗1个月后检测,抗-HBs阳转率达85.63%,与加强免疫前比较差异有统计学意义(P<0.001).结论:本校学生注射重组酵母乙肝疫苗应答良好,但全程免疫3年后建议对学生的抗-HBs进行复查,必要时加强接种.
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重组酵母测评系统检测环境雌激素的影响因素探讨
目的:探讨重组酵母测评系统中影响β-半乳糖苷酶活性的因素.方法:以乙烯雌酚为受试物,研究在检测环境雌激素的重组酵母测评系统中,振荡和非振荡培养、酵母扩增时间、受试物作用时间和裂解方式等对酶活性的影响.结果:在非振荡培养条件下,可检出乙烯雌酚的雌激素活性,且与振荡培养条件下的雌激素活性差异无统计学意义(P>0.05).非振荡培养时,在18~30 h内,随酵母扩增时间的延长,酶活性逐渐增加,30 h后,酶活性则随扩增时间的延长而逐渐降低;各剂量组的乙烯雌酚作用时间以30 h时酶活性高,若将作用时间延长至48h,酶活性则明显下降(P<0.01);在不同裂解方式下,各剂量组乙烯雌酚的酶活性大小顺序为:液氮裂解>Y-PER裂解>彗星实验裂解液裂解>SDS+氯仿(CHCl3)裂解>超声破碎.结论:重组酵母测评系统检测环境雌激素的优化组合为:恒温培养箱中酵母扩增24~30 h,受试物作用30 h,Y-PER或液氮裂解酵母细胞.