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Adr亚型HBV中蛋白基因的T载体克隆及序列分析
构建含适当限制酶切位点的adr亚型乙肝病毒(HBV)中蛋白基因克隆,比较分析序列变化,用作HBV疫苗表达及诊断试剂的研究.患者血清经蛋白酶K消化,再以酚-氯仿抽提,对提取物进行PCR扩增.回收PCR阳性产物,经琼脂糖酶消化后直接克隆至T载体.转化后提取质粒经PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:10份血清提取物的PCR有3份获阳性产物,分别经T载体克隆后转化DH10b菌,3株阳性克隆经酶切及序列分析显示同属于adr亚型,与国内已发表序列的同源性大于99.6%.提示该克隆是用作HBsAg蛋白表达或探针标记研究的理想克隆.
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Adr亚型HBV转染人胎盘滋养层细胞株的体外研究
目的 通过转染adr亚型HBV-DNA,建立可复制HBV的人胎盘滋养层细胞(HPT-8).方法 采用脂质体介导的方法将重组真核表达质粒pcDNA3-3HBV转染人胎盘滋养层细胞,经G418筛选,通过ELISA、免疫组化、PCR等方法对转染细胞和培养上清分别进行检测.结果 HPT-8细胞稳定转染质粒pcDNA3-3HBV后,第1、2代转染细胞的培养上清ELISA检测显示HBsAg、HBeAg阳性,免疫组化检测显示转染细胞胞浆中HBsAg、HBcAg呈阳性信号,PCR检测培养上清中HBV-DNA呈阳性,荧光定量PCR检测其滴度达9×106拷贝/L,并且转染滋养细胞中有HBV-rcDNA和 HBV-cccDNA存在.结论 重组质粒pcDNA3-3HBV能在人滋养层细胞中表达、转录、复制.
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Adr亚型乙型肝炎病毒转染细胞模型的构建
目的 建立乙型肝炎病毒(HBV)复制状态的细胞模型.方法 利用分子亚克隆技术,将9600bp的adr亚型HBV全基因克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和HindⅢ位点构建pcDNA3-3HBV,通过脂质体介导的方法转染HepG2细胞,G418筛选.结果 成功构建了质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染后培养上清,ELISA检测结果显示,HBsAg、HBeAg阳性,且PCR检测前S/S基因阳性.PCR证实转染细胞中有HBV cccDNA存在,RT-PCR证实HBV S基因mRNA的表达.结论 重组质粒pcDNA3-3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制.
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adr亚型HBsAg冻干实验参考品的制备与检测
目的 制备用于检测重组酵母表达的adr亚型HBsAg含量的实验参考品.方法 重组酵母表达的adr亚型HBsAg溶液经纯化后,经3家实验室联合标定蛋白含量,准确稀释并加入保护剂,使抗原终含量为10 μg/ml,分装安瓿后,冷冻干燥熔封,制备成adr亚型实验参考品.再由不同实验室用不同试剂和不同方法,以联合标定的蛋白含量为定量标准,分别验证冻干参考品中adr亚型HBsAg含量及37 ℃放置不同时间的稳定性.并以adw亚型HBsAg标准作为定量标准,检测adr亚型参考品中HBsAg含量.结果 所制备的adr亚型冻干参考品分装准确均匀;以联合标定蛋白含量为标准,不同实验室分别以珠式EIA法和RIA法所测的adr亚型冻干参考品HBsAg含量与目标含量相近,各支参考品间差异小;adr亚型冻干实验参考品37 ℃放置2～10周后质量稳定.以adw亚型HBsAg参考品为定量标准,所测定adr亚型冻干参考品HBsAg含量,比实际含量约高出0.6倍.结论 冻于adr亚型HBsAg实验参考品可用于重组酵母表达adr亚型HBsAg的定量检测.不同亚型HBsAg检测需用各自亚型的参考品作为定量标准.
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adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体的制备
目的 制备adr和adw亚型乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)单克隆抗体,并用其区分两亚型HBsAg.方法 利用杂交瘤细胞融合技术制备adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体,采用间接ELISA法进行筛选;优化鉴别试验抗原包被剂量,并对HBsAg亚型鉴别试验进行验证.结果 共获得抗两亚型HBsAg的单克隆抗体7株;鉴别试验抗原的佳包被剂量为10 μg; 1H6和4D3株单抗检测2份编盲adw亚型HBsAg样品的adwA 450/adrA450值均大于2,判定其为adw亚型;1E9株单抗检测2份编盲adr亚型HBsAg样品adrA450/adwA450值均大于2,判定其为adr亚型;3A5株单抗检测4份编盲样品的adrA450/adwA450值和adwA 450/adrA450值均小于2,未能区分两亚型HBsAg.结论 抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别.
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稳定表达HBsAg的P815细胞株的建立及鉴定
目的:筛选并建立稳定表达亚洲人常见的adr亚型HBsAg的P815细胞株,为乙肝DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型.方法:用PCR方法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pcDNA3载体,并通过脂质体转染P815细胞,G418筛选.结果:构建了重组质粒pcDNA3-HBsAg(S),转染细胞及其培养上清中均可检测到HBsAg(S)的存在,PCR扩增也证实HBsAg(S)基因已稳定整合于P815细胞的染色体中.结论:获得了稳定表达HBsAg的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测乙肝DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础.
