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HBV preS2反义锁核酸在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果
目的:探讨针对HBV preS2基因mRNA翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片段在2.2.15细胞内抗HBV复制和表达的作用.方法:分别合成三段互补于HBV preS2基因mRNA翻译起始区同一靶位的反义锁核酸、全硫代反义寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体作为载药体系,作用于HepG22.2.15细胞,采用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)动态检测细胞上清液中HBsAg和HBV DNA的含量,并比较其抑制HBV DNA复制与表达的作用;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果:加入LNA后第1天,即出现对HBsAg表达和HBV DNA复制的抑制作用,第7天,未修饰反义寡核苷酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、反义锁核酸组对HBsAg表达的抑制率分别达45.79%、52.92%和67.21%;对HBVDNA复制的抑制率分别达35.15%、40.69%和52.16%.其中LNA抑制病毒活性强且对细胞代谢无影响.各组与对照组比较均有显著性差异(均P<0.01),且反义LNA组与其他ASODN组比较也有显著性差异(均P<0.05).结论:针对preS2基因的反义锁核酸体外能有效抑制HBV的复制与表达,故preS2基因可作为乙型肝炎基因治疗的有效靶位.
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Adr亚型HBV中蛋白基因的T载体克隆及序列分析
构建含适当限制酶切位点的adr亚型乙肝病毒(HBV)中蛋白基因克隆,比较分析序列变化,用作HBV疫苗表达及诊断试剂的研究.患者血清经蛋白酶K消化,再以酚-氯仿抽提,对提取物进行PCR扩增.回收PCR阳性产物,经琼脂糖酶消化后直接克隆至T载体.转化后提取质粒经PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:10份血清提取物的PCR有3份获阳性产物,分别经T载体克隆后转化DH10b菌,3株阳性克隆经酶切及序列分析显示同属于adr亚型,与国内已发表序列的同源性大于99.6%.提示该克隆是用作HBsAg蛋白表达或探针标记研究的理想克隆.
