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乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体的构建及鉴定
目的 构建乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体,为进一步研究以乙脑病毒为载体的新型疫苗奠定基础.方法 (1)构建了两个乙脑病毒复制子:一个为完全缺失PrM/E基因(命名为Full △prM/E Replicon);一个保留E基因C端213 bp(命名为Partial △prM/E Replicon),并代之以多克隆位点.(2)将复制子RNA转染BHK-21细胞,于24、48、72、96 h采用Real-time PCR验证复制子的自主复制能力.(3)于复制子多克隆位点处插入YFP报告基因,并将含报告基因的复制子RNA转染BHK-21细胞,采用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测验证YFP的表达.结果 (1)两个复制子RNA转染BHK-21细胞后,RNA有随时间增加而不断增多的趋势.(2)含报告基因的复制子RNA转染BHK-21细胞后,荧光信号持续增强,表达YFP的阳性细胞率也逐渐增多.结论 构建的乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体Full △prM/E Replicon及Partial △prM/E Replicon具有自主复制能力及对外源蛋白的表达能力.
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单细胞四重巢式荧光聚合酶链反应进行血友病A基因诊断和性别鉴定的研究
目的 建立快速有效检测血友病A基因诊断和性别鉴定的单细胞聚合酶链反应(PCR)方法.方法 联合6个与凝血因子Ⅷ(FⅧ)紧密连锁的STR位点(DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108和F8Civs13)通过多重荧光PCR进行正常人群多态性分析和血友病A家系基因诊断,从中选取杂合度和诊断率较高的STR位点联合性别位点牙釉蛋白基因(Amelogenin gene)建立单淋巴细胞多重巢式荧光PCR的检测方法.结果 选择了3个杂合度和诊断率较高的STR位点(F8Civs13、DXS1073和DXS15)联合性别位点建立了单细胞四重巢式荧光PCR的检测方法.Amelogenin、DXS15、F8Civs13和DXS1073在男性的单细胞扩增成功率分别为94.3%、91.4%、100%和100%,在女性为100%、97.1%、97.1%和97.1%.该女性的DXS1073和DXS15位点呈杂合子,均未发现等位基因脱失现象.扩增皆未发现假阳性和假阴性的情况.结论 建立的单细胞四重巢式荧光PCR方法快速有效,有望应用于临床血友病A非创伤性产前基因诊断.
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胎儿甲型血友病的基因诊断
目的 探讨胎儿甲型血友病的产前基因诊断方法的临床应用价值.方法 2002年1月至2006年12月对北京朝阳医院妇产科19个甲型血友病家系进行基因携带者检测,应用长距离PCR(LD-PCR)技术检测其凝血因子Ⅷ(FⅧ)内含子22倒位情况,出现倒位者直接行脐静脉穿刺抽取脐带血进行胎儿血友病基因的产前诊断;非倒位者则联合应用多位点基因连锁分析技术先对携带者进行筛查,而后进行胎儿血友病基因的产前诊断.同时进行胎儿脐带血FⅧ水平的检测.结果 (1)对19例孕妇的22次妊娠的胎儿进行了产前诊断,平均脐静脉穿刺孕周为23周(17～34周),所有穿刺均获成功,无穿刺导致的胎儿丢失.(2)19个甲型血友病家系中,有14个家系检测出内含子22倒位,对其16次妊娠胎儿行产前甲型血友病基因诊断,其中10例胎儿诊断为甲型血友病;6例诊断为正常胎儿.(3)多位点基因连锁分析技术产前诊断甲型血友病胎儿6例,其中包括1例孕妇先后2次妊娠甲型血友病胎儿.(4)22例胎儿中有16例进行了FⅧ水平检测(未行检测的6例为孕周低于20周或因经济原因患者家属拒绝),FⅧ水平在0～198%之间,有11例胎儿FⅧ水平＜10%,其中除1例FⅧ水平为2%,诊断为正常胎儿并随访1年FⅧ水平正常外,其余10例胎儿均诊断为甲型血友病.结论 应用LD-PCR和多位点基因连锁分析技术可以快速有效地进行甲型血友病携带者的确认;胎儿脐带血FⅧ水平的检测有助于初步诊断,但确诊胎儿是否患病仍须有基因诊断结果.
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X连锁肾上腺脑白质营养不良的携带者筛查及产前诊断探讨
目的探讨X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD)的携带者筛查及产前诊断方法.方法应用气相色谱-质谱联用法对83例X-ALD可疑携带者血浆、9例高危孕妇羊水细胞及其中5例胎儿出生后的血浆中极长链脂肪酸(VLCFAs)水平进行了检测.应用PCR、测序方法对31 例X-ALD可疑携带者及羊水细胞VLCFAs增高的男性及女性各1例进行了基因突变分析.结果 83 例X-ALD可疑携带者中,51例血浆VLCFAs水平增高,31例ABCD1基因突变分析,29例有突变.9例胎儿中,7例羊水细胞VLCFAs水平正常,2例增高(1例男性,1例女性).5例出生后进行了血浆VLCFAs水平检测,结果与产前诊断结果相一致. 2例羊水细胞VLCFAs水平增高的胎儿,均有ABCD1基因突变,其核苷酸与氨基酸的改变分别为871G>A(E291K)和726G>A(W242X).结论血浆及羊水细胞中VLCFAs水平检测结合基因突变分析可以准确地进行X-ALD携带者筛查及产前诊断.
关键词： 肾上腺脑白质营养不良 脂肪酸类 杂合子检测 产前诊断 -
SMN基因缺失多重连接探针扩增法检测和识别脊柱肌肉萎缩症的纯合型或杂合型SMN基因缺失
Objective: Spinal muscular atrophy(SMA), an autosomal recessive neuromuscular degeneration of the anterior horn cells of the spinal cord and brain stem, results in one of the most common diseases with muscle fatigue and atrophy. Most SMA cases including all the types are due to the homozygous deletion of at least exon 7 within the survival motor neuron 1 (SMN-1) gene. Although a "golden standard" assay (PCR with mismatch primer followed by enzyme digestion) is very reliable for the identification of homozygous SMN-1 deletion, the carrier detection of heterozygous SMN-1 deletion remains a challenge. Methods: Some PCR-based gene dosage assays or multiplex PCR allow for the determination of the copy number of SMN-1 gene to identify heterozygous deletion, but these procedures are often time consuming and available on a limited clinical basis. Recently developed MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) is an efficient procedure that can accurately analyze relative quantification to establish the copy number of the SMN gene. We performed a validation for simultaneous detection of homozygous SMN-1 deletions of SMA patients and heterozygous SMN-1 deletions of SMA carriers in a simple assay using a MLPA-SMA assay specific reagent. Results: Six out of 20 patients with SMA were found to have homozygous SMN-1 deletion, confirmed by the PCR/digestion assay. All 4 parents of the children with SMA had heterozygous SMN-1 deletion, confirmed by an independent relative quantitative analysis. Conclusion: MLPA provides a simple, rapid and accurate method of simultaneously detecting homozygous deletions and heterozygous deletions in a single assay for both SMN-1 and SMN-2 genes.
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一种新的RHD合子型直接测定方法
目的建立简易的RHD合子型直接测定方法.方法根据RHD基因序列和RHD基因缺失的原理设计两对引物,分别特异性针对RHD基因第一外显子和融合Rh盒子,再引入一对内对照引物,建立新的双管复式PCR方法;并用于检测152份已知RHD基因序列和基因型的DNA样本、以及359份已知Rh表型样本的RHD合子型.检测结果与使用近期报道的限制性片段长度多态性(RFLP)技术的鉴定结果相比较.结果 152份已知RHD基因序列和基因型的DNA样本包括92份Rh阴性、28份D放散型、3例部分D表型、5例弱D型及24例Rh阳性样品,全部样品的RHD合子型PCR检测结果均与已知的基因型相符合,可直接判断RHD(+)/RHD(+)、RHD(+)/RHD(-)和RHD(-)/RHD(-)三种合子型;359份已知Rh表型的样本,包括12例孕妇配偶、18名家系成员、48例Rh阴性及281例Rh阳性捐血者,PCR检测结果,除一例外,均与RFLP结果一致.该个例PCR检测为RHD(+)/RHD(-)杂合型,而RFLP结果为RHD(-)/RH1D(-)纯合型,由于个例为Rh阳性表型,肯定存在至少一条RHD基因,所以显然RFLP检测下游Rh盒子出现假阴性.结论双管PCR技术鉴定RHD合子型,简便、快速,具有较高的准确率,可常规用于临床或血库实验室.
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秦皇岛市门诊妇女人类乳头瘤病毒感染情况分析
宫颈癌作为仅次于乳腺癌的女性常见恶性肿瘤，越来越受到人们的重视，也成为全球研究的热点课题之一。宫颈局部感染是宫颈癌发生、发展的高危因素之一，大量研究资料表明，人类乳头瘤状病毒（ HPV）是宫颈局部感染的重要病原体，其持续感染与宫颈癌及宫颈癌前病变密切相关，90％以上的宫颈癌患者发病是由于HPV特别是高危型HPV感染引起的［1］。虽然高危型HPV的重要型别在不同区域的分布上存在着一致性，但不同地域仍存在各自的优势型别。本研究通过对545例妇女宫颈分泌物进行HPV分型检测，以了解不同型别HPV在秦皇岛市的感染分布情况，结果如下。
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Bcl I位点在血友病A携带者检测中的应用
目的 探索一种更简便、更特异的方法用于血友病A的基因诊断.方法 采用聚合酶链反应-限制性片断多态性方法对8个血友病A家系进行Bcl I位点检测.结果 Bcl I位点杂合率为24%(4/17).可以为其中3个血友病A家系提供诊断信息,信息率为3/8.结论 Bcl I位点为血友病A基因多态性遗传标志之一,用于血友病A基因诊断有较大价值.
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毛细管电泳定量聚合酶链反应法对杜氏/贝氏进行性肌营养不良携带者的评估价值
目的:评估毛细管电泳定量聚合酶链反应法对杜氏/贝氏进行性肌营养不良携带者的诊断价值.方法:于2002-05/2004-02选择杜氏/贝氏进行性肌营养不良家系女性成员10例为观察对象,为携带者组,来自中山大学附属第三医院神经科门诊收集的杜氏/贝氏进行性肌营养不良男性患儿7例的家系(编号A-G),其中一级亲属9例(患儿母亲、同胞姐妹),二级亲属1例;以健康青年女性10例为对照组.用毛细管电泳定量分析7例杜氏/贝氏进行性肌营养不良家系中的10例女性亲属和10名正常对照的18对引物的二步多重聚合酶链反应产物,计算计量系数(DQ值).DQ=(携带者组检测峰面积/参照峰面积)/(对照组检测峰面积/参照峰面积).若DQ值约等于1.0,受检位点外显子为双拷贝;若DQ约等于0.5,受检位点外显子为单拷贝,据此判断为携带者.结果:纳入受检者20例,均进入结果分析.①杜氏/贝氏进行性肌营养不良患儿基因缺失类型:患儿A缺失外显子45～50;患儿B缺失外显子45;患儿C缺失外显子51;患儿D缺失外显子51;患儿E缺失外显子45～48;患儿F缺失外显子45～52;患儿G缺失外显子12,13.②毛细管电泳结果表明家系成员AⅡ1,BⅡ1,DⅡ1,GⅡ1(均系患儿的母亲)在缺失位点上的峰较对照组相应位点上的峰明显降低.而家系成员AⅡ2(患儿姨母),CⅡ1,EⅡ1,FⅡ1(患儿母亲),FⅢ1,GⅢ1(患儿姐妹)在缺失位点上的峰较对照组相应位点上的峰一样高.③毛细管电泳定量分析表明AⅡ1在外显子45,47,48,50处的DQ值为其余位点的一半,系单拷贝,故判断AⅡ1缺失外显子45～50;其他受检者BⅡ1缺失外显子45;DⅡ1缺失外显子51;GⅡ1缺失外显子12,13,毛细管电泳对AⅡ1,BⅡ1,DⅡ1,GⅡ1定量诊断的基因缺失位点与其先证者的基因缺失位点一致,故诊断为肯定携带者.结论:毛细管电泳定量聚合酶链反应法是一种准确、快速、简便的杜氏进行性肌营养不良携带者的诊断方法.
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假肥大型肌营养不良基因携带者检测方法的研究进展
假肥大型肌营养不良(DMD)在儿童神经肌肉系统疾病中发病率高,预后差,目前尚无有效的治疗方法,故携带者的检出对预防患儿出生具有重要意义.传统的检测方法漏诊率高,使用有限,近年来在基因检测方面取得了一定进展.文章主要介绍假肥大型肌营养不良基因携带者的基因检测方法,并将携带者分为缺失型和非缺失型分别进行综述.
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p73基因在肝细胞癌中的表达及其临床意义
背景:p73基因是新发现的一种抑癌基因,其在肿瘤发生、发展中的作用尚不明确.目的:探讨p73基因在肝细胞癌中的表达、突变程度及其与临床预后的关系.方法:采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测35例肝细胞癌和配对癌旁组织,以及10例转移淋巴结和10例正常淋巴结组织中p73基因的表达;采用内含子PCR产物StyⅠ酶切分析法调查标本的杂合性;采用PCR-单链构象多态性(SSCP)检测p73基因的突变情况.结果:35例肝细胞癌组织中有26例p73 mRNA呈高表达,癌旁组织则呈低表达,两者表达率有显著差异(P＜0.01);20例中高分化癌组织中有13例p73 mRNA呈中高表达,15例低分化癌组织中有13例p73 mRNA呈中高表达,两者阳性率之间有显著差异(P＜0.01);18例Ⅰ～Ⅱ期肝细胞癌标本中有9例p73 mRNA呈中高表达,17例Ⅲ～Ⅳ期肝细胞癌标本中p73 mRNA均呈中高表达,两者阳性率之间有显著差异(P＜0.05).10例转移淋巴结组织中p73 mRNA均呈高表达,而10例正常淋巴结组织中均呈低表达,两者之间有显著差异(P＜0.01).12例杂合性肝细胞癌组织标本中,有10例p73基因存在G/C:A/T双等位基因表达,在癌旁组织中则均为G/C表达,未见A/T表达.肝细胞癌和癌旁组织中未见p73基因突变.结论:p73基因的表达与肝细胞癌的分化程度、临床分期和预后有关,突变可能不是p73基因起作用的主要方式.
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重组表达载体pIRES-Rb94的构建及其对肺腺癌A549细胞株中SphK表达的影响
目的 构建真核表达质粒pIRES-Rb94,观察Rb94基因对鞘氨醇激酶(SphK)表达的影响.方法 根据Rb94基因序列设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRKS-Rb94,经脂质体转染A549细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.采用Real-time RT-PCR和Western boltting法检测Rb94基因并观察其对人肺腺癌A549细胞株SphK表达的影响.结杲成功构建重组表达质粒pIRE-Rb94,转染A549细胞后获得稳定转染细胞株pIRES-Rb94-A549,该细胞株中Rb94基因高效表达;SphK1表达下调而SphK2表达上调.结论 真核表达质粒pIRES-Rb94科构建成功并可有效转染A549细胞,Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达.
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鼻咽癌染色体3p14的精细等位基因缺失分析
目的进一步明确鼻咽癌染色体3p14区域等位基因杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)的频率与共同缺失区范围,以便分离该区域内与鼻咽癌相关的候选抑瘤基因.方法选择位于3p14的6个高密度微卫星多态标记,对32例鼻咽癌组织进行LOH分析.结果 71.88%(23/32)的鼻咽癌在至少1个位点发生LOH,丢失频率较高的3个位点是D3S1313(46.43%)、D3S1300(50.0%)和D3S1312(44.44%).在存在丢失的23例患者中,8例表现为一个连续的非随机的LOH区域,其小共同缺失区为D3S1313～D3S1312(约3.4个厘摩).且该区域的缺失与鼻咽癌临床分期、EB病毒感染有明显关系.结论鼻咽癌在3p14的小共同缺失区位于D3S1313～D3S1312之间,该区域可能存在一个尚未克隆的与鼻咽癌发生发展密切相关的抑瘤基因.
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革兰阳性菌与载体技术研究进展
基因载体技术是生物工程技术的关键环节.在众多的基因载体中,细菌载体技术近年来得到较快的发展.细菌载体分为革兰阳性菌及革兰阴性菌载体.尽管革兰阳性菌载体技术起步较革兰阴性菌晚,但革兰阳性菌有许多革兰阴性菌所不可比拟的优点,其应用前景更为广阔.现就革兰阳性菌载体的种类、特性及应用价值作一综述.
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miR-3960真核表达载体的构建及其对成骨细胞矿化的影响
目的:构建miR-3960的真核表达载体,并观察其对成骨细胞矿化的影响.方法:设计引物合成miR-3960的前体序列,将其克隆到真核表达载体pSilencer4.1-CMV puro中,构建成pSilencer4.1-miR-3960重组体.通过酶切及测序证实构建是否成功.随后将miR-3960表达载体转染小鼠基质细胞ST2,Northern blot检测miR-3960表达水平.用BMP-2诱导ST2细胞向成骨细胞分化,通过检测钙沉积量来观察对成骨细胞矿化的影响.结果:pSilencer4.1-miR-3960真核表达载体经酶切及测序鉴定正确.pSilencer4.1-miR-3960转染ST2细胞后,能有效表达miR-3960.经BMP-2诱导分化5d后,稳定转染组钙沉积量较对照组显著增加.结论:成功构建了真核表达载体pSilencer4.1-miR-3960,转染ST2细胞后能有效表达.miR-3960可以促进成骨细胞矿化.
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白血病微卫星杂合性缺失的研究
①目的检测白血病微卫星杂合性缺失(LOH)频率,探讨LOH在白血病发病中的作用.②方法利用合成的11,12号染色体上的10个微卫星位点引物进行PCR扩增,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法分析30例不同类型白血病病人的LOH.③结果 30例白血病病人中,有13例发生了1个以上位点的LOH,约占43.3%.其中18例急性白血病病人中有12例发生LOH;12例慢性白血病病人中仅有1例出现LOH,并于检出后60d发生了急粒变,二者LOH频率比较,差异有显著性(P=0.019).④结论 LOH是急性白血病发病过程中的频发事件,检测LOH是寻找与急性白血病发生密切相关的抑癌基因的有效筛选方法.
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甲型血友病携带者的PCR-RFLP检测
①目的探讨甲型血友病携带者的基因诊断方法.②方法应用聚合酶链反应(PCR)结合限制性酶切片段长度多态(RFLP)分析技术,对5个甲型血友病家系的29名成员进行了FⅧ基因外显子18和内含子22两个多态位点的扩增片段限制酶切长度多态性连锁分析.并对其中的1个家系进行了产前基因诊断.③结果 5个家系中有5名女性被确定为携带者,1个家系的男性胎儿被确定为病人.④结论 PCR-RFLP方法可对多数甲型血友病进行基因诊断.
关键词： 血友病 杂合子检测 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性
