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应用果蝇S2细胞高效表达甲型H1N1流感病毒可溶性HA蛋白及其活性分析
目的 应用果蝇S2细胞表达甲型H1N1流感病毒可溶性HA蛋白,并评估其免疫活性.方法 以甲型H1N1流感A/Shenzhen/71/09病毒株作为模版,采用RT-PCR技术扩增HA基因,构建持续性表达载体pAC5.1-HA,协同筛选载体pCoblast共转染至S2细胞,通过Blasticindin抗生素筛选获得稳定转染的S2细胞株.利用Western Blot技术鉴定细胞上清HA蛋白表达,使用Ni亲和柱纯化重组HA蛋白.使用HA免疫BALB/c小鼠3次,利用ELISA检测HA特异性抗体效价.结果 成功克隆A/Shenzhen/71/09 HA基因,长度约1.7×103 bp.将HA基因克隆入pAC5.1-V5/His载体,经过转染、抗生素筛选后获得稳定表达HA的S2细胞株,目的蛋白以分泌形式表达于上清,相对分子质量约75×103 D.免疫小鼠后可诱导机体产生抗HA特异性抗体,免疫后10d、30 d效价分别为1∶1280、1∶5120.结论 获得可溶性表达的HA蛋白,并具有良好的免疫活性,为后期流感免疫诊断试剂的研制、亚单位疫苗的开发、单克隆抗体的制备奠定了基础.
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基于果蝇S2系统的流感病毒样颗粒的制备及鉴定
目的 应用果蝇S2表达系统制备流感病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)并鉴定其活性.方法 将前期构建的果蝇持续性表达载体pAc-V5-HA、NA、M1与pCoblast共转染至S2细胞,应用杀稻瘟菌素(Blasticindin)结合限制性稀释法筛选共整合流感HA、NA、M1三种基因的单克隆S2细胞株.利用PCR技术鉴定细胞内三种基因整合,Western-Blot技术鉴定细胞上清中VLPs,通过血凝试验评估HA蛋白的凝集效价,通过水解唾液酸的能力评价NA活性.结果 应用PCR技术从单克隆S2细胞株基因组中成功扩增流感HA、NA和M1基因;Western-Blot证实细胞上清含有整合HA、NA和M1蛋白的流感VLPs;血凝试验证实流感VLPs能有效凝集鸡红细胞(效价1∶160);NA活性测定发现,流感VLPs能有效水解唾液酸,且呈剂量依赖性,在高剂量(250 ng、500 ng)条件下VLPs和野生型病毒的NA活性相近.结论 成功建立整合流感HA、NA、M1基因的单克隆S2细胞株,该细胞可以持续产生流感VLPs,VLPs具有良好的HA和NA活性,可以作为有效的新型流感疫苗.
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瞬时受体电位C通道与糖尿病的相关性研究进展
瞬时受体电位通道是细胞膜上一类重要的非选择性阳离子通道.1969年,Cosens和Manning[1]发现,突变体果蝇的视觉系统在持续性光刺激后可产生一种瞬时而非持续的峰电位,瞬时受体电位通道因此得名.在哺乳动物中,研究人员已发现28种瞬时受体电位通道亚型,依据氨基酸序列的同源性分属于6个亚家族[2],其中瞬时受体电位C通道是瞬时受体电位通道家族中早发现的成员,与果蝇属的瞬时受体电位通道同源性高.
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极低频电磁场暴露对果蝇生殖和寿命影响的研究
目的 探讨极低频电磁场(extremely low frequency electric and magnetic fields,ELF-EMF)不同暴露时间对雌、雄果蝇生殖、寿命、氧化应激水平的影响.方法 未交配雌、雄果蝇于50 Hz、3 mT ELF-EMF全天连续暴露1、2、3 d,测定其寿命、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、子代数量、子代雌雄比.结果 暴露2、3 d雌蝇及暴露3 d雄蝇,其子代F1数量、雌雄比均显著降低(P＜0.05或P＜0.01),雄性子代数量较多.暴露雌、雄果蝇体内SOD活性升高但无显著性差异(P＞0.05),MDA水平随着暴露时间增加梯度递增,其中雌蝇暴露2、3 d后MDA水平极显著高于对照组(P<0.01),雄蝇暴露2、3 d后MDA含量与对照组相比均显著升高(P＜0.05或P＜0.01).暴露处理后40 d内,雄蝇死亡率随着暴露时间增加;而雌蝇生存曲线变化与对照组基本一致.暴露后雌、雄果蝇平均寿命与半数死亡期与暴露时间呈负相关.结论 经50 Hz、3 mT ELF-EMF暴露可降低果蝇生殖能力和寿命,影响子代性别决定,诱导果蝇产生氧化应激反应.
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果蝇作为学习记忆实验动物模型的研究回顾
目的回顾应用果蝇作为学习记忆模式动物的研究工作.方法文献调研.结果经实验室筛选出dnc、rut、amn、rad、cabbage、turnip、radish、nalyot、tumip、nemyp153、ala等表现条件反射行为障碍的突变体,且已证实与cAMP信号转导途径有关.经现代免疫组化研究发现蕈状体/蘑菇体(mushroom bodies)有多种基因产物的优势表达,成为果蝇的嗅觉、视觉学习和记忆过程起关键作用的神经解剖区.果蝇的学习记忆与个体发育程度有关.果蝇幼虫训练形成的条件性嗅觉回避反应,在幼虫蜕变为成虫后(8 d)仍然存在,这为研究长时记忆的机制提供了一个有用的模型.dnc和amn突变体不能形成这一长时记忆.结论遗传学背景较为清晰的果蝇,由于具有各类学习记忆的能力,已成为研究学习记忆机制的重要实验动物.
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果蝇三龄幼虫中枢神经元细胞培养
目的:建立果蝇幼虫中枢神经元细胞培养方法,为研究吸入麻醉药相关的离子通道建立实验模型.方法:取晚期三龄幼虫的脑腹神经节经解剖、酶解、冲洗、吹打、接种、培养步骤进行分散细胞的原代培养,并用膜片钳技术记录全细胞电流以检测培养细胞的功能.结果:培养的神经元细胞生长活跃,状态良好,具有神经元的特征-轴突生长及形成网络连接.以"全细胞方式"记录到的电压依赖性K+电流在不同细胞之间电流动力学和幅度变化较大,呈多样性.结论:果蝇中枢神经元可在体外进行培养,方法稳定可靠;培养的神经元细胞生长活跃,状态良好,为进行吸入麻醉药的电生理机制提供良好实验模型.
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决定七氟醚敏感性的基因在果蝇常染色体的定位研究
目的 在染色体水平对决定果蝇七氟醚敏感性的基因进行定位.方法 将H(黑腹)处女雌蝇与e(黑檀体)雄蝇进行杂交产生杂合子一代(F1).取F1雄蝇与eF1处女雌蝇进行侧交产生子二代(F2).按性别及表型分别测定三代果蝇七氟醚麻醉的ED50值,比较侧交F2中黑腹、黑檀体表型果蝇和H、e自交F2果蝇的ED50值,并作浓度-效应曲线.结果 杂合F1ED50与HF1ED50相等,大于eF1的ED50值.侧交F2中49.76%表现为黑腹,50.24%表现为黑檀体.F2中黑腹和黑檀体ED50值大于eF2的ED50,小于HF2的ED50值,且其量-效曲线均为双峰组成,而H和e自交F2的量-效曲线均为单峰.结论 决定黑腹果蝇对七氟醚敏感性的基因位于果蝇第二号染色体.
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芝麻素散剂抗衰老作用的药理学研究
目的:观察芝麻素散剂的抗衰老作用.方法:果蝇寿命实验,观察含不同浓度芝麻素培养基中生长的果蝇生存时间,计算平均寿命、平均高寿命和半数死亡时间;抗氧化实验,给予不同剂量芝麻素30 d后测定老龄小鼠血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;同时观察芝麻素散剂对阳虚小鼠体重、体温及低温游泳存活时间的影响及其对脾虚模型小鼠耐寒及耐疲劳能力的影响.结果:与对照组比较,芝麻素散剂能明显降低老龄小鼠血清MDA含量,可保持阳虚证动物的体温,明显延长小鼠低温游泳的存活时间,亦能显著延长脾虚小鼠在低温条件下的生存时间和负重游泳时间,但对老龄小鼠血清SOD活性和果蝇平均寿命及平均高寿命均无明显影响.结论:芝麻素散剂具有抗应激和抗氧化作用,但没有延长果蝇寿命的作用.
关键词： 芝麻素 抗衰老药(中药)/药理学 果蝇属 抗氧化剂/药理学 应激 -
淫羊藿、肉苁蓉、巴戟天对果蝇寿命影响的研究
目的研究淫羊藿、肉苁蓉、巴戟天 3种药物对果蝇寿命的影响. 方法采用在实验组的培养基中适量加入上述的 3种药物,而在对照组的培养基中则不加药物,观察各组的生存时间. 结果实验组果蝇的平均寿命高于对照组果蝇的平均寿命. 结论适量应用淫羊藿、肉苁蓉、巴戟天,具有延缓衰老的功效.
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人类CC3配体样蛋白1在果蝇Schneider-2细胞的表达和活性分析
目的 对HIV-1辅助受体趋化因子受体5(CCR5)配体人类CC3配体样蛋白1(CCL3L1)进行果蝇Schneider-2细胞融合蛋白表达,纯化后活性分析.方法 克隆人类CCL3L1cDNA,构建CCL3L1表达载体pMT/BiP/His,获得Schneider-2果蝇细胞表达的His-CCL3L1融合蛋白,同时克隆pCDNA3.1-flag-CCR5表达载体,培养稳定表达flag-CCR5的细胞株,检测表达人趋化因子CCL3L1活性.结果 成功构建人趋化因子CCL3L1融合蛋白真核表达载体pMT/BiP/His,表达并纯化出融合蛋白His-CCL3L1.免疫沉淀法和Western印迹法分析发现,纯化的His CCL3L1蛋白能特异性结合CCR5受体,His-CCL3L1蛋白在浓度1～50 nmol/L存在剂量依赖性,50～100 nmol/L无剂量依赖性.结论 果蝇Schneider-2细胞表达的His-CCL3L1蛋白具有与天然CCL3L1相同的生物学活性,为进一步探讨CCL3L1影响HIV-1感染的机制奠定了基础.
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PIWI蛋白在人类结肠癌组织中的表达及临床意义
目的 分析PIWIL1、PIWIL3和PIWIL4三种蛋白在结肠癌组织和癌旁组织中的表达与临床意义.方法 选用106例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织标本,分别制成62点和150点2份组织芯片,采用免疫组织化学方法检测结肠组织芯片中PIWIL1、PIWIL3和PIWIL4的表达.采用SPSS 17.0统计学软件,不同组织间PIWI蛋白表达差异采用配对t检验或配对Wilcoxon检验,相关性采用Pearson或Spearman等级相关分析.结果 PIWIL1、PIWIL3、PIWIL4在结肠癌组织中的表达均显著高于癌旁组织(P＜0.01).PIWIL1、PIWIL3、PIWIL4在结肠癌和癌旁组织中的表达均呈现两两显著正相关(均P＜0.01).癌组织PIWIL1在低分化组的表达显著高于高分化组(t=-2.840,P＜0.01).癌组织PIWIL3表达随着临床分期的升级呈现显著升高(F=3.112,P＜0.05).癌组织PIWIL3和PIWIL4在有远处转移组的表达显著高于无远处转移组(t=-3.349,P＜0.01;t=-2.168,P＜0.05).癌组织PIWIL3和PIWIL4的表达均与结肠癌的发生显著相关(P值均＜0.01).结论 PIWIL1、PIWIL3、PIWIL4在结肠癌组织中的表达与结肠癌的分化、临床分期、有无远处转移等临床指标显著相关,且PIWIL3和PIWIL4的表达是结肠癌发生的独立相关因素,有望进一步研究探讨其是否能作为结肠癌早期诊断的分子标志物及分子治疗靶点.
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阿尔采末病模式生物研究进展
随着家族性阿尔采末病的研究的发展,人们建立了很多阿尔采末病的模式生物模型,如线虫、果蝇和小鼠模型,这些模型是研究阿尔采末病神经病理变化非常有效的模型.本文主要介绍了各种转基因阿尔采末病模型的研究特点,以及利用这些动物模型寻找新的神经保护药物和药物治疗靶点的研究进展.
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黑檀体果蝇七氟醚麻醉ED50值测定
目的为在染色体水平对决定果蝇吸入麻醉药敏感性的基因进行定位选择合适的果蝇品系.方法用单瓶连续法测定7天龄野生黑腹果蝇(HYM3,H)和黑檀体果蝇(ebony,e)七氟醚麻醉ED50值,将两种品系果蝇七氟醚麻醉ED50值进行比较.结果黑腹果蝇和黑檀体果蝇七氟醚麻醉ED50值分别为(0.768±0.021)%和(0.657±0.031)%(P＜0.01),两种品系果蝇七氟醚半数麻醉有效浓度有极显著性差异.结论黑檀体果蝇可用于决定黑腹果蝇对七氟醚麻醉敏感性的基因的定位研究.
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利用果蝇模型研究帕金森病的发病机制
帕金森病(Parkinson's disease PD)是发病率仅次于阿尔兹海默症的一类神经退行性疾病,其基本病理特征是黑质致密区多巴胺(DA)神经元变性伴胞浆内嗜酸性包涵体即Lewy小体形成,导致尾状核、壳核中DA含量减少及黑质纹状体通路破坏.迄今为止,导致多巴胺能神经元退变的原因仍不十分清楚.目前与家族性PD有关的基因位点已经发现了13个,其中鉴定并报道有突变的有6个:α-SYN(PARK1/4)、Parkin(PARK2)、UCHL1(PARK5)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)和LRRK2(PARK8).果蝇因其遗传学上的优势而被广泛地应用于人类疾病的研究.果蝇神经系统DA的合成与人类类似,同时果蝇的DA系统也参与了运动控制,因此,目前普遍认为,果蝇DA神经元的死亡导致运动功能障碍与PD发病的情况具有可比性.果蝇含有Parkin,PINK1、D J-1和LRRK2等PD发病相关基因的同源基因,因此它是一种非常重要的PD模型.文中综述了目前以果蝇模型为主要方法研究PD发病机制的新进展.
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黑体果蝇七氟醚麻醉ED50值测定
目的在染色体水平对决定果蝇吸入麻醉药敏感性的基因进行定位,选择合适的果蝇品系.方法用单瓶连续法测定7 d龄野生黑腹果蝇(HYM3, H)和黑体果蝇(black body,b)七氟醚麻醉ED50值,将两种品系果蝇七氟醚麻醉ED50值进行比较. 结果黑腹果蝇和黑体果蝇七氟醚麻醉ED50值分别为(0.790±0.023)%和(0.557±0.029)%,经t检验,两种品系果蝇七氟醚半数麻醉有效剂量差异有极显著性意义(P<0.01).结论黑体果蝇可用于决定黑腹果蝇对七氟醚麻醉敏感性基因的定位研究.
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玛咖对果蝇和小鼠繁殖能力与睡眠的影响
【目的】研究玛咖对果蝇和雄性小鼠性能力、繁殖能力以及睡眠的影响。【方法】用含有玛咖粉末（01．％，02．％）的培养基培养果蝇，检测玛咖对果蝇交配数以及羽化成虫数量的影响。进一步用玛咖混悬溶液按01．g／kg剂量和02．g／kg剂量给成年雄鼠连续灌胃15d，通过检测小鼠精液品质、观察其睾丸和附睾的组织学变化，并记录其子代生育情况，以评价小鼠的生殖力。通过直接睡眠动物数、戊巴比妥钠协同睡眠潜伏期、延长戊巴比妥钠睡眠时间以及戊巴比妥钠阈下剂量协同催眠动物数等指标来检测不同剂量组（01．g／kg ，02．g／kg和04．g／kg）玛咖对小鼠睡眠的影响。【结果】实验结果表明玛卡能显著提高果蝇的性交配率以及生殖率，增加并能明显增强小鼠睾丸的发育、提高精液品质，也能提升生育率和平均窝仔数以及子代平均体重和存活率。睡眠实验表明，玛咖不会引起实验动物直接睡眠，但能延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间，缩短其入睡潜伏期；在戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验中能明显增加睡眠动物数。【结论】玛咖在不同的动物模型上都能提高雄性动物的性能力，增加其繁殖能力；并能改善动物睡眠。
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EZH2在原发性肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义
目的 探讨果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH 2)蛋白在原发性肝细胞性肝癌(HCC)中的表达状况及其临床意义.方法 应用免疫组化S-P法检测原发性肝细胞性肝癌50例、肝硬化30例、正常肝组织9例中EZH2蛋白的表达.结果 EZH2蛋白主要表达于细胞核,原发性肝细胞性肝癌、肝硬化和正常肝组织的EZH2蛋白阳性表达率分别是88.00%(44/50)、46.67%(14/30)、33.33%(3/9),且EZH2蛋白在原发性肝细胞性肝癌组织中的表达明显高于在肝硬化和正常肝组织中的表达(χ2=16.07,10.09,P＜0.01).结论 EZH2异常表达与原发性肝细胞性肝癌的发展密切相关,在原发性肝细胞性肝癌的发展过程中起重要的作用.
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原花青素与珍珠粉混合物对老龄大鼠肝细胞、线粒体酶及果蝇生存期的影响
目的通过对老龄大鼠肝细胞及线粒体酶活性、果蝇生存期的检测,探讨原花青素与珍珠粉混合物延缓衰老的作用机制.方法以原花青素与珍珠粉混合物为受试物,将20月龄SD大鼠随机分为空白对照组和0.1g/(kg.bw)(低)、0.2g/(kg.bw)(中)、0.6g/(kg.bw)(高)3个剂量组,每组11只动物,连续灌胃35 d,取肝脏,测定肝细胞及线粒体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)的含量.将Oregon K野生型黑腹果蝇随机分为空白对照组和0.007%、0.013%、0.040%、0.120%剂量组,每组400只,雌雄各半,隔天一次统计果蝇存活数、死亡数,直到全部死亡,计算平均寿命、高寿命及半数死亡时间.结果原花青素与珍珠粉混合物各剂量组均能升高老龄大鼠肝细胞线粒体GSH-Px活性(P＜0.05或P＜0.01),中、高剂量组能升高SOD活性(P＜0.05或P＜0.01)和降低MDA含量(P＜0.05或P＜0.01);受试物亦能升高老龄大鼠肝细胞SOD活性和降低MDA含量(均P＜0.01);果蝇生存试验中,受试物各剂量组的半数死亡时间比对照组延长2～8 d,且明显延长果蝇的平均寿命和高寿命.结论原花青素与珍珠粉混合物可能通过提高肝细胞及线粒体GSH-Px、SOD活性,减少机体氧自由基生成而达到延缓衰老的作用.
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EZH2和Survivin在肝癌肝硬化和正常肝组织中的表达及其临床意义
目的:分析果蝇Zeste 基因增强子同源物2(EZH2) 和生存素(Survivin)在原发性肝细胞性肝癌(HCC)中的表达及其临床意义.方法:应用免疫组化S-P法检测HCC 50例、肝硬化30例、正常肝组织9例中EZH2、Survivin蛋白的表达.结果:HCC、肝硬化和正常肝组织的EZH2蛋白阳性表达率分别是88.00%、46.67%、33.33%,三者之间的差异有统计学意义;HCC、肝硬化和正常肝组织的Survivin蛋白阳性表达率分别是78.00%、30.00%、11.11%,三者之间的差异有统计学意义.结论:EZH2和Survivin异常表达与HCC的发展密切相关,在HCC的发展过程中起非常重要的作用; EZH2、Survivin在HCC中的表达关系密切,呈正相关.
关键词： 肝肿瘤/病理学 肝硬化/病理学 果蝇属 zeste基因增强子同源物2 生存素
