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树鼩、熊猴感染人乙型肝炎病毒肝细胞内感染指征的研究
目的对树鼩、熊猴感染人乙型肝炎病毒(HHBV)后对肝细胞病变进行动态观察.方法10只成年树鼩,28只熊猴接种含人乙型肝炎病毒(HBV)血清后,定期肝活检,采用HE染色、免疫组化、原位杂交对实验动物肝组织进行研究分析.结果80%树鼩感染HHBV后,通过免疫组化在肝组织内可找到乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),50%通过原位杂交可检测到HBV DNA.有25%熊猴的肝组织内可检测到HBsAg,但信号较弱,而肝组织内未发现HBV DNA.结论树鼩感染HHBV后,肝细胞内出现病理改变,适用于对人乙型肝炎的研究.
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黄曲霉毒素B1诱发树鼩肝癌过程中的差异表达蛋白质分析及意义
目的比较黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发的树鼩肝细胞癌生长不同阶段的蛋白质表达谱的改变,筛查在AFB1诱发的肝癌发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子.方法用双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)对同一动物自身的癌发生前肝组织(A45W),癌发生后的肝癌组织(ACa)及未经AFB1处理的对照组动物肝组织(E45W)进行了相互比较.结果A45W组、ACa组、E45W组分别平均检测到(1 255±43)个蛋白点(n=3)、(1 198±50)个蛋白点(n=3),和(1 252±40)个蛋白点(n=3),以其中A45W组图谱为参考胶,ACa组、E45W组分别与其匹配的平均匹配点数为(818±39)个(n=3)和(777±45)个(n=3),平均匹配率分别为66%和62%.癌与癌前比(ACa vs A45W),相差2倍以上的上调点和下调点分别为108个(包括癌特异点)和75个;癌前与未经AFB1处理的对照组比(A45W vs E45W),相差2倍以上的上调点有78个,下调点有21个.质谱可鉴定出不均一核糖核蛋白A1、不均一核糖核酸核蛋白A2/B1、peroxiredoxin 1、peroxiredoxin 2、膜联蛋白4、肌球蛋白α链等26种胶内差异蛋白质.结论在AFB1诱发的树鼩肝癌发生不同阶段有明显的差异性蛋白表达谱,为进一步对人肝癌蛋白质组的研究提供了线索.
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丙型肝炎病毒体外可感染树鼩肝细胞
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)体外感染树鼩原代肝细胞.方法用HCV RNA阳性血清感染原代树鼩肝细胞,并用感染后细胞培养上清液进行传代感染,通过检测受染肝细胞正、负链HCV RNA、培养上清液中包装后HCV RNA,并对比分析感染前后病毒准种变化等指标,评价感染是否成功.结果受染树鼩肝细胞自第5～10天可检出负链HCV RNA,而正链RNA至感染后第14天仍可检出;感染后3～14 d培养上清液中可检出HCV RNA,且呈RNA酶抗性;培养上清液中病毒可传代感染新的树鼩肝细胞;感染前后HCV准种分析显示树鼩肝细胞可被特定的准种选择性感染,而传代感染后肝细胞可检出新的准种.结论原代树鼩肝细胞体外可被HCV感染且支持病毒复制.
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用树鼩cDNA芯片研究树鼩肝癌中参与信号传导的部分基因变化情况
目的利用树鼩cDNA芯片研究黄曲霉毒素B1(AFB1)和(或)乙型肝炎病毒(HBV)引起的树鼩肝细胞癌(HCC)发生过程中参与信号传导的部分基因表达变化情况,从而进一步探讨HCC发生的分子机制.方法实验树鼩分3组:A组(AFB1组)、B组(AFB1+HBV组)、C组(正常对照组).所有动物在实验过程中定期接受剖腹手术取肝组织检查,至肝癌形成时处死动物取肝癌和癌旁组织.用树鼩cDNA芯片检测实验第30、60、90周肝活检组织、肝癌组织及其癌旁组织中各基因的表达情况,并用实时逆转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR)法验证cDNA芯片结果.结果在A组和B组从癌前到癌变过程中胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)、C-rel、核因子-κ B2(NF-κ B2)均显示有差异表达,同时bcl-2、细胞周期素A(cyclin A)、睫状神经营养因子(CNTF)仅在B组显示有差异表达.而C组这几个基因无差异表达.实验组与对照组比较,在诱癌的早、中期(30、60周)均出现CNTF及cyclin A的差异表达.real time RT PCR结果与cDNA芯片检测结果基本一致.A组IGF-Ⅱ、C-rel基因及B组IGF-Ⅱ基因,在肝癌组织表达水平明显低于癌旁及实验30、60周组织,而癌旁与实验30、60周相比较则无明显差异;B组CNTF基因在癌旁、肝癌及60周之间比较无明显改变,但均明显高于30周;A组CNTF基因表达水平在癌旁、肝癌组织高于癌前组织,但差异无统计学意义;C组这3个基因不同时期比较亦无明显差异.结论树鼩部分信号传导通路相关cDNA芯片应用于检测树鼩HCC发生过程中信号传导通路中各基因表达的变化,对进一步了解树鼩HCC发生的机制有重要实用价值.IGF-Ⅱ、NF-κ B2、C-rel、Bcl-2、cyclin A及CNTF这几个基因与树HCC的发生发展密切相关.
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树鼩实验性肝癌发生过程p53基因的变化
目的探讨由人乙型肝炎病毒(HBV)和黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发的树鼩肝细胞癌变过程,p53基因的表达及变化.方法将树鼩分为四组:A组:HBV+AFB1,B组:只感染HBV;C组:只摄入AFB1;D组:作空白对照.定期肝活检,用免疫组织化学、分子生物学等技术对实验树鼩肝及肿瘤组织进行检测.结果 (1)接受HBV及AFB1双因素的A组,肝细胞癌(HCC)发生率(66.7%)明显高于只接受HBV的B组或AFB1的C组(30%),而且HCC的平均发生时间也明显早于C组,(120.0±16.6)周与(153.3±5.8)周,t=3.336,P＜0.01.(2)在第75周前各组动物肝均未检出突变的p53蛋白.(3)105周时,A组p53蛋白表达率为78.6%,B组为60%,C组为71.4%,D组为10%(x2≥5.03,P＜0.05).在A、C组检出p53基因异常带.(4)树鼩肝癌p53基因突变点分别位于2 7 5、7 8及1 3密码子;其野生型p 5 3基因的核苷酸及氨基酸序列与人的p 5 3基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为91.7%、93.4%.结论再次证实HBV和AFB1有协同致肝癌作用;突变的p53蛋白出现于肝细胞发生癌变之前,p 5 3基因的突变促进了肝癌的发生和演进.HBV可能协同AFB1致p 5 3基因突变.
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用cDNA阵列技术研究黄曲霉毒素B1诱发树鼩肝癌形成过程中的基因变化
目的对树鼩肝癌形成过程中的基因表达差异进行动态分析,探讨肝癌发生的分子机制.方法用cDNA阵列技术,将2例黄曲霉毒素B 1诱发的树鼩肝癌组织分别与其癌旁组织和其肝癌形成前的活检肝组织、实验前对照和同期对照肝组织进行基因表达水平的6种比较分析.结果不同的比较方式所显示的差异表达的基因谱不同,可归为4类:癌组织表达高于癌旁组织、癌旁组织表达高于癌发生前肝的组织;癌与癌旁表达水平相仿,但高于癌发生前的肝组织;癌组织下调,低于癌旁组织;癌发生前表达上调,在癌发生后表达下调.结论对肝癌形成过程中不同时期的肝组织基因表达水平进行动态对比分析,有助于阐明肝癌发生的分子机制并终筛选出与肝癌发生有关的关键基因.
