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重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定
目的 制备表达人肝细胞生长因子(HGF)-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒.方法 酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NK4载体,线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组pAd-NK4病毒载体.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2.RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4 mRNA表达.结果 酶切鉴定得到阳性pAd-NK4重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装.在转染2d后能观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达.制备的Ad- NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达.结论 成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据.
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Ad(E1-).sT治疗乳腺癌移植瘤的作用及体内免疫激活效应
目的 研究复制缺陷型腺病毒Ad(E1-).sT治疗小鼠乳腺癌移植瘤的作用,探讨Ad(E1-).sT的免疫激活效应.方法 指数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1按2×106细胞/100μl PBS皮下荷瘤4～6周龄的BALB/c小鼠,建立具有完全免疫系统的乳腺癌移植瘤模型.荷瘤后第7天,将成瘤小鼠分为Buffer治疗组、Ad(E1-).Null治疗组和Ad(E1-).sT治疗组,分别瘤内给予PBS、Ad(E1-).Null和Ad(E1-).sT(2.5×1010 VPs/小鼠)进行治疗;第10天,重复治疗一次.于第7、12、15、19天,分别测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,于第12、18天,内眦静脉取血,检测小鼠血象和外周血T淋巴细胞亚型;于第19天处死小鼠,剥离肿瘤,测定肿瘤重量,并分离脾脏细胞,测定树突状细胞(DCs)的比例和数量.结果 Ad(E1-).sT治疗能够有效抑制乳腺癌移植瘤的生长,抑制肿瘤重量的增加.在机制上,Ad(E1-).sT能够调节小鼠外周血的血象,抑制淋巴细胞、粒细胞和中间细胞的增长;同时,Ad(E1-).sT能够促进T淋巴细胞的成熟和分化,降低未成熟淋巴细胞的比例,促进CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的增殖.此外,Ad(E1-).sT还增强小鼠脾脏DCs的扩增与成熟.结论 Ad(E1-).sT可通过调节机体抗肿瘤免疫反应,抑制乳腺癌移植瘤的生长.
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Ad-PSMA转染树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养抗前列腺癌的实验研究
我们前期成功构建了携带前列腺特异性膜抗原基因的复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA~([1]),本研究将Ad-PSMA转染树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,评价效应细胞抗前列腺癌(PCa)的生物学效应.
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复制缺陷型腺病毒Ad-p14ARF治疗肝细胞癌的实验研究及作用机制的探讨
目的 研究复制缺陷型重组腺病毒Ad-p14ARF用于肿瘤基因治疗的可行性及其作用机制.方法 利用Ad-Easy系统构建并扩增了Ad-p14ARF复制缺陷型腺病毒;应用台盼蓝细胞计数法和倒置相差显微镜观察Ad-p14ARF对肝癌细胞的生长抑制作用;AnnexinV/PI双染法结合流式细胞仪检测不同滴度的Ad-p14ARF作用后肝癌细胞的凋亡情况;Western blot法检测相关蛋白的表达情况,构建皮下肝癌移植瘤裸鼠模型,研究Ad-p14ARF在体内的抑瘤活性.结果 Ad-p14ARF可以明显抑制野生型p53和突变型p53表型的肝癌细胞增殖、生长.Annexin V/PI双染色法显示,Ad-p14ARF能促进肝癌细胞株HepG2和BEL7402的细胞凋亡,凋亡细胞比例与腺病毒滴度呈现一定的剂量相关性.凋亡相关蛋白检测提示,Ad-p14ARF能上调p53下游基因Bax、p21的表达.体内抑瘤试验显示,Ad-ECRG2可以明显抑制肝癌细胞BEL7402裸鼠移植瘤的生长.结论 p14ARF基因的导入可以通过p53依赖和非依赖途径抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,有望在恶性肿瘤的基因治疗中发挥重要作用.
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sCD80-Linker-sCD40L融合基因腺病毒载体的构建
目的:构建携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体.方法:在GenBank检索人CD80、CD40L及IL-12b编码基因序列,确定扩增区域,设计引物.以Trizol抽提人外周血单个核细胞总RNA,使用RT-PCR方法获得IL-12b信号肽、sCD80、sCD40L等基因的编码序列,并分别克隆人T载体.重叠PCR构建sCD80-Linker-sCD40L融合基因,克隆人T载体.使用Stratagene公司AdEasy XL Adenoviral VectorSystem试剂盒构建携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体.结果:经测序证实,正确克隆了人IL-12b信号肽、sCD80、sCD40L编码序列,构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的T载体,并进一步构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体.本实验病毒滴度为2×1010cfu/ml.结论:成功构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体.
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腺病毒介导VEGF和HO-1联合治疗缺血随意皮瓣的实验研究
目的 探讨复制缺陷型腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF165)和血红素氧化酶(HO-1)联合应用,对提高大鼠超长随意皮瓣成活面积的影响和作用机制.方法 将25只健康纯种成年雌性SD大鼠的背部两侧各设计一6cm×1cm大小随意皮瓣.皮瓣远端皮下分别注射目的基因联合应用组 (Ad-VEGF165+Ad-HO-1)、基因对照组(Ad-VEGF165)、基因对照组(Ad-HO-1) 、绿色荧光蛋白基因对照组(Ad-11B-GFP)、病毒保存液(Ad-buffer)为空白对照组,共5组.术后7d,分别测量皮瓣的成活面积、HE染色及目的蛋白和CD31免疫组化表达情况及皮瓣新生微血管密度(MVD)检测等.结果 目的基因联合应用组皮瓣成活面积、目的蛋白表达及MVD与其他4组比较,其差异有显著统计学意义(P ＜0.01).结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,联合应用VEGF和HO-1基因治疗能显著增加大鼠随意皮瓣的成活面积,促进皮瓣存活.
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携突变减毒Stx1编码序列重组腺病毒的构建及其抗乳腺癌的活性
目的:构建携带1/100、1/1 000减毒活性的突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1, Stx1) 编码序列的复制缺陷型腺病毒,并观察其抗人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的活性.方法:重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/100、1/1000的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后构建携带该编码序列的复制缺陷型腺病毒载体Adv-Stx-1R170L.制备人乳腺癌T47D细胞移植瘤裸鼠模型,Adv-Stx-1R170L肿瘤局部注射给药,评价其体内抑瘤能力.结果:经测序证实正确克隆了1/100、1/1 000减毒活性的突变减毒Stx1编码序列,成功构建携带该突变减毒Stx1编码序列的复制缺陷型腺病毒载体Adv-Stx-1R170L.体内实验显示,Adv-Stx-1R170L可以有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长,与携带绿色荧光蛋白编码序列的腺病毒对照组、PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建了携带1/1 000原毒素活性的突变减毒Stx1编码序列的重组复制缺陷型腺病毒载体,该病毒载体可以有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长,且未见明显毒性作用.
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腺病毒提高腺相关病毒在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达及其机制
目的: 研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制.方法: rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒(Ad5-RFP)或条件复制型腺病毒(Ad5-TERT-RFP)感染人非小细胞肺癌细胞系(NCI-H446)、人肺腺癌细胞系(A549)、人胃癌细胞系(SGC7901)、人口腔黏膜上皮癌细胞系(KB)和人口腔黏膜上皮癌耐长春新碱细胞系(KB/VCR).荧光显微镜观察和流式细胞仪分析肿瘤细胞感染后GFP的表达;Western blotting检测感染后肿瘤细胞GFP蛋白表达及ERK和AKT磷酸化水平;Real-time PCR检测肿瘤细胞内GFP的mRNA表达量、DNA拷贝数,以及细胞表面受体HSPG、αv integrin和FGFR-1的mRNA表达.结果: 流式细胞结果显示,rAAV2-GFP联合Ad5-RFP或Ad-TERT-RFP感染肿瘤细胞24 h后,GFP阳性细胞率和GFP平均荧光亮度分别提高了约0.3～3倍和4～8倍.Western blotting证实联合应用Ad5-RFP感染肿瘤细胞后24 h,GFP蛋白表达增加约4～6倍,肿瘤细胞内ERK和AKT磷酸化水平升高.联合感染后细胞内GFP的mRNA表达量提高了3.83～7.33倍,DNA拷贝数未见明显改变,HSPG、αv integrin和FGFR-1的mRNA表达轻微提高.结论: 低剂量腺病毒显著提高rAAV2在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达水平,可能与激活信号传导通路、增加细胞内转录有关.
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依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平
目的:研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响.方法: 携带外源基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP(MOI为1或10)单独或联合终质量浓度为0.2、2、20、40、80、100和200 μg/ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446(人非小细胞肺癌细胞株)、A549(人肺腺癌细胞株)、SMMC-7721(人肝癌细胞株)、SGC7901(人胃癌细胞株)、SKBR-3(人乳腺癌细胞株)和BTT(小鼠膀胱移行上皮癌细胞株)后不同时间,流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度,Western blotting检测EGFP蛋白表达,RT-PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数.结果: 不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平,但对EGFP阳性率无明显提高.10 MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40 μg/ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT 24 h后,细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3.3、3.5、3.1、6.2、7.0、5.4和3.4倍.Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2～5倍,EGFP mRNA表达量提高,但DNA拷贝数未见明显改变.结论: 依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平,该作用可能是在转录水平上发挥作用的.
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MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响
目的: 构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA-7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性.方法: 通过基因操作技术将启动子(hTERTp)+目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同时构建对照病毒AdTP-EGFP.TCID50法测定病毒滴度.应用蛋白质印迹法检测MDA-7在肿瘤细胞株中的表达状态;通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异.结果: 成功构建携带目的基因的腺病毒载体,PCR鉴定正确;蛋白质印迹结果表明MDA-7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡,如A549,SGC-7901等,在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时,原代细胞中没有检测到MDA-7表达;结晶紫染色试验结果表明AdTP-mda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTP-EGFP.结论: 成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡.
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负载人细胞色素P4502B6基因的复制缺陷型腺病毒感染前列腺癌PC-3细胞的研究
目的 探讨负载人细胞色素P450(CYP2B6)基因的复制缺陷型腺病毒感染PC-3前列腺癌细胞的效果及CYP2B6表达.方法 将负载CYP2B6基因的复制缺陷型腺病毒以200 VP/cell的感染复数(MOI),感染人前列腺癌PC-3细胞；采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测PC-3细胞内CYP2B6的表达丰度,并以Western blot检测CYP2B6蛋白表达水平.结果 与阴性对照腺病毒比较,负载CYP2B6基因的腺病毒感染PC-3细胞后,可显著提高PC-3细胞CYP2B6mRNA表达水平(8.12±2.41比0.92±0.19,P＜0.05)及CYP2 B6蛋白表达水平(0.82±0.23比0.12±0.06,P＜0.05)；而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组PC-3细胞表达CYP2B6 mRNA(0.78±0.27比0.92±0.19)和CYP2B6蛋白(0.14±0.03比0.12 ±0.06)的水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可向前列腺癌PC-3细胞中有效导入CYP2B6基因,并在PC-3细胞中表达.
关键词： 前列腺癌 细胞色素P450基因 复制缺陷型腺病毒 -
人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备
目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒.方法:酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NP9载体,线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒.结果:酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强.结论:成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础.
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MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肺腺癌A549细胞凋亡的影响
目的：构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因---黑色素瘤分化相关基因鄄7（MDA鄄7）的复制缺陷型腺病毒，并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因（MDA鄄7）插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域，构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA鄄7鄄EGFP；同时构建对照病毒Ad.EGFP。病毒滴度计算按寇化法（Kar鄄ber法）进行腺病毒感染性滴度（TCID50）测定。应用免疫组化染色法检测MDA鄄7在感染2种病毒的肺腺癌 A549细胞中的表达状态；通过二苯甲亚胺鄄碘化丙啶（Hoechst33342鄄PI）双染色法及流式细胞仪检测2种病毒对肿瘤细胞杀伤的差异。结果成功构建携带目的基因的腺病毒载体，经聚合酶链反应（PCR）鉴定正确；MDA鄄7在感染Ad.hMDA鄄7鄄EGFP的肺腺癌A549细胞中表达，以相同感染复数（MOI）值感染Ad.EGFP时肺腺癌A549细胞中未检测到MDA鄄7表达；Ad.hMDA鄄7鄄EGFP对肿瘤细胞株杀伤能力明显高于Ad.EGFP。结论成功构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA鄄7鄄EGFP，并证实MDA鄄7蛋白在肿瘤细胞中过表达，诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡。
