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共表达人B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定
目的 构建能同时表达B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒载体,同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒,检测其在喉癌细胞中的表达.方法 构建以串联方式携带人B7.1和HGF/NK4基凶的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1.Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-NK4-B7-1.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株.用RT-PCR检测感染细胞中B7.1和NK4基因mRNA表达.结果 酶切鉴定证实阳性pAdTrack-NK4-B7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF/NK4,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强.制备的Ad-NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6 d高水平的B7-1和NK4基因的表达,整体表达可持续2周.结论 成功构建了同时表达B7-1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因,为进一步研究B7-1和NK4基凶的功能及应用B7-1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材.
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重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定
目的 制备表达人肝细胞生长因子(HGF)-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒.方法 酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NK4载体,线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组pAd-NK4病毒载体.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2.RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4 mRNA表达.结果 酶切鉴定得到阳性pAd-NK4重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装.在转染2d后能观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达.制备的Ad- NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达.结论 成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据.
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PAMAM-NK4纳米复合物对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用
目的:探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine dendrimer,PAMAM)介导NK4基因对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长的抑制作用及对MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型的治疗作用.方法:制备PAMAM-NK4纳米复合物颗粒,纳米复合物和空载体PAMAM分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞作为实验组和对照组.MTT实验、West-ern blotting和流式细胞术分别检测转染PAMAM-NK4对细胞增殖、NK4蛋白表达和细胞凋亡的影响.40只雌性裸鼠经皮下注射建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型,随机分成4组,每组10只裸鼠:空白组肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml 0.9％NaCl溶液、空载体组注射0.2ml含100μg PAMAM-LacZ质粒的溶液、给药组注射0.2 ml含100 μg PAMAM-NK4质粒的溶液、阳性对照组腹腔注射0.2 ml多柔比星(100 μg)溶液.连续注射7d,第30天处死裸鼠,完整摘除肿瘤,测量肿瘤体积和质量.Western blotting检测各组移植瘤组织NK4蛋白表达.结果:PAMAM-NK4纳米粒转染MDA-MB-231、MCF-7细胞后能够稳定表达NK4蛋白、抑制细胞增殖和增加细胞凋亡率.成功建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型,给药组和阳性对照组肿瘤体积及质量显著低于空白组(P＜0.05),且安全性良好;给药组NK4蛋白表达显著高于空白组(P＜0.05).结论:PAMAM-NK4纳米粒对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长具有抑制作用,并对人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型具有治疗作用.
关键词： 聚酰胺-胺型树枝状高聚合物 NK4基因 乳腺癌 基因治疗 -
NK4基因转染对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响
背景与目的:NK4不仅是肝细胞生长因子的拮抗剂,而且是血管形成的抑制剂.研究已经证实NK4可以抑制肿瘤的生长和转移,但有关其在胰腺癌中的作用,目前少见文献报道.为此,本研究旨在探讨NK4基因在裸鼠体内的抗胰腺癌作用及其可能的机制.方法:建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,构建NK4基因真核细胞表达载体并转染入瘤体内,转染前后称其体重、瘤重和测肿瘤体积,采用免疫组织化学和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术对裸鼠胰腺癌组织中的凋亡细胞、增殖抗原和微血管密度进行观察和比较.结果:4周后,NK4转染组裸鼠移植瘤体积为(1.39±0.33)cm3,明显小于对照组和空载体组[(2.06±0.55)cm3和(1.90±0.36)cm3,P＜0.01];其瘤重为(1.30±0.81)g,也显著低于对照组和空载体组[(3.45±1.88)g和(3.14±1.51)g,P＜0.01],抑瘤率为62.29%.NK4转染组肿瘤细胞的凋亡指数为9.34±0.91,显著高于对照组和空载体组(4.13±0.79和3.94±1.03,P＜0.001);而NK4转染组肿瘤细胞的增殖指数为53.88±4.30,与对照组间和空载体组比较无显著性差异(56.24±4.03和54.33±5.41,P＞0.05);NK4转染组肿瘤组织的微血管密度为(12.24±4.63),明显低于对照组和空载体组(20.13±7.00和19.70±6.15,P＜0.05).结论:转染NK4基因可显著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长,其作用机制可能是通过抑制肿瘤新生血管的形成,促进肿瘤细胞凋亡.
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转染NK4基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学特性的影响
背景与目的:肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)通过其受体c-Met的激活,在调节肿瘤侵袭和转移和血管形成中具有重要作用.NK4不仅是HGF的拮抗剂,也是血管形成的抑制剂,阻断HGF/c-Met途径和肿瘤血管的形成可成为抗肿瘤治疗的策略之一.为此,我们构建NK4基因真核细胞表达载体并进行转染研究,探讨NK4基因在胰腺癌细胞中的表达及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响.方法:对重组pcDNA3/hNK4质粒进行酶切,将NK4基因克隆到真核表达载体pRC/CMV2,应用脂质体将重组pRC/CMV2-hNK4质粒转入胰腺癌SW1990细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)分别检测转染的肿瘤细胞中NK4 mRNA和蛋白的表达并筛选出高表达的细胞克隆.采用Transwall小室和Matrigel侵袭小室测定转染NK4基因对胰腺癌细胞运动和侵袭的影响.结果:转导NK4基因的SW1990细胞可表达并分泌NK4,RT-PCR扩增出预期的453bp片段,Western blot显示有50 000的NK4蛋白,转染NK4基因对胰腺癌细胞SW1990的生长无抑制作用(P＞0.05),但可显著抑制HGF或成纤维细胞所诱导胰腺癌细胞的运动和侵袭(P＜0.01),而转染空载体则无此作用(P＞0.05).结论:转染NK4基因可抑制胰腺癌细胞的运动和侵袭,在胰腺癌抗转移治疗中可能具有重要作用.
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HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒表达系统的构建与鉴定
目的:构建靶向结肠癌细胞的人端粒酶逆转录酶HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒并对该表达体系进行鉴定.方法:根据GenBank中的HTERT启动子(HTERTp)序列设计引物,以人胚肾293细胞提取基因组DNA为模板,PCR扩增HTERTp,并将HTERTp序列克隆入pDC312质粒中,构建成HTERTp调控的腺病毒质粒pSG-HTERTp; NK4 cDNA酶切并回收克隆至pSG-HTERTp载体中,构建成pSG-HTERTp/pA-NK4穿梭质粒,脂质体法在293细胞中包装重组腺病毒；噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒；RT-PCR检测NK4基因的转录；Western Blot检测NK4蛋白的表达.结果:成功构建出成功构建出HTERT 启动子调控的NK4基因重组腺病毒,滴度为4.5×109空斑形成单位(pfu)/mL,且PCR扩增及westernbolt电泳均呈阳性表达.结论:成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,为进一步研究NK4基因的作用机制打下实验基础.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动 NK4基因 腺病毒 -
肝细胞生长因子拮抗剂NK4抑制肿瘤的机制
0 引言肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是由间质细胞产生的细胞因子,作用于肿瘤细胞表面的跨膜受体c-Met蛋白,引起肿瘤细胞的浸润、转移,而且HGF对新生血管的生成起促进作用.1997年Date等[1]用胰弹性蛋白酶对重组人HGF进行消化裂解,发现了一种新的全面拮抗HGF生物活性功能的拮抗剂-NK4.
