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共表达人B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定
目的 构建能同时表达B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒载体,同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒,检测其在喉癌细胞中的表达.方法 构建以串联方式携带人B7.1和HGF/NK4基凶的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1.Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-NK4-B7-1.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株.用RT-PCR检测感染细胞中B7.1和NK4基因mRNA表达.结果 酶切鉴定证实阳性pAdTrack-NK4-B7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF/NK4,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强.制备的Ad-NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6 d高水平的B7-1和NK4基因的表达,整体表达可持续2周.结论 成功构建了同时表达B7-1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因,为进一步研究B7-1和NK4基凶的功能及应用B7-1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材.
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转染B7-1基因的Raji和Jurkat细胞诱导细胞因子mRNA表达的研究
为探讨B7共刺激分子在T细胞活化和分化中的作用,利用脂质体介导的转基因技术将B7基因导入恶性血液病细胞系Raji和Jurkat细胞,用流式细胞术检测转基因前、后B7-1基因的表达,用RT-PCR检测T细胞表面细胞因子IL-2,IL-4和IFN-γ mRNA的表达及这3种细胞因子在转基因后4,12,20及48小时的时间动态变化.结果发现,B7+Raji细胞可诱导T细胞分泌细胞因子IL-2,IL-4和IFN-γ,B7+Jurkat细胞可诱导IL-2和IFN-γ的分泌,而B7-Raji细胞及B7-Jurkat细胞均未诱导细胞因子的分泌.IL-2和IL-4在T细胞活化4小时即可检测到,IFN-γ在T细胞活化12小时可检测到,在20小时出现峰值.结论:B7-1基因的导入可有效地增强肿瘤细胞的免疫原性,激活T细胞,B7-1在T细胞活化和分化中起着更主要的作用.
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转染MIP-1α和B7-1基因增强小鼠的抗淋巴瘤效应
目的 观察转染趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤的效应.方法 将MIP-1α和B7-1基因慢病毒重组载体转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞,应用RT-PCR检测MIP-1α和B7-1基因mRNA表达,Western blot法检测MIP-1α和B7-1蛋白表达；转基因EL-4细胞注入小鼠右腋皮下,观察成瘤情况；灭活的转基因EL-4细胞注入成瘤小鼠体内,观察其增强小鼠抗淋巴瘤效应.结果 RT-PCR检测发现EL-4/MIP-1α+ B7-1细胞内有MIP-1α及B7-1 mRNA表达,Western blot显示MIP-1 α及B7-1蛋白表达；MIP-1α组、B7-1组较对照组成瘤时间延长,成瘤率降低,肿瘤平均体积较小,而联合组成瘤性消失；MIP-1α和B7-1治疗组的肿瘤平均体积、重量及肿瘤器官转移率明显小于对照组(P＜0.05),而联合组的肿瘤平均体积及重量明显小于MIP-1α和B7-1组(P＜0.05),而且联合组小鼠平均生存期,均较单基因组、对照组明显延长(P＜0.05).结论 转染MIP-1α和B7-1基因能够明显增强小鼠机体抗淋巴瘤效应,明显延长荷瘤小鼠的平均生存期,为淋巴瘤的基因治疗提供了新的思路.
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重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.
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B7-1基因转染对骨肉瘤细胞生物学行为的影响
目的:研究B7-1真核表达载体pcDNA3-B7-1转染对骨肉瘤细胞株LM8的生物学行为的影响.方法:用脂质体(lipofectamine)介导B7-1基因和空载体pcDNA3转染LM8细胞,G418筛选得到抗性克隆,分别命名为LM8/B7-1和LM8/pcDNA3,用聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞仪(FCM)鉴定转染基因的表达,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)和FCM检测细胞体外增殖活性,并观察转染细胞在C3h小鼠体内致瘤能力.结果:RT-PCR和FCM显示B7-1基因在骨肉瘤细胞株LM8中呈高表达,LM8/B7-1体外增殖活性与LM8/pcDNA3和LM8细胞差异并无显著性(P＞0 05),但LM8/B7-1的致瘤能力显著下降(P＜0.01).结论:B7-1基因对骨肉瘤细胞的体内增殖能力产生明显抑制作用,可以作为骨肉瘤基因治疗的理想目的基因之一.
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IFN-γ、IL-12对B7-1转染肝癌细胞诱导T淋巴细胞活化的影响
目的探讨B7-1基因转染肝癌细胞与IFN-γ、IL-12联合在体外诱导T细胞活化的能力.方法酶联免疫吸附反应(ELISA)检测联合诱导瘤苗刺激淋巴细胞IFN-γ、IL-12蛋白合成及细胞表面CD4、CD8、CD25的表达.MTT法检测瘤苗对淋巴细胞增殖作用的影响.结果HepG2/B7-1细胞诱导淋巴细胞表达IL-2、IFN-γ,其蛋白质含分别为875 pg/ml和1 246pg/ml;而联合IL-12、IFN-γ后能进一步诱导IL-2、IFN-γ的蛋白质合成,较各自无细胞因子组明显提高(P＜0.05).细胞表面CD4、CD8、CD25的表达显著增加.两者联合促进了淋巴细胞的增殖,在E/T=10:1时,较HepG2组明显增大.结论IL-12、IFN-γ增强经B7-1基因转染的肝癌细胞(HepG2/B7-1)诱导淋巴细胞产生IL-2、IFN-γ的能力;IL-12、IFN-γ可能通过调节B7-1分子的生物学活性影响其对T细胞的活化.
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B7-1基因修饰的胃癌细胞诱导抗胃癌主动免疫研究
目的探讨B7-1基因转染胃癌细胞是否具有抗肿瘤主动免疫增强作用.方法采用重组腺病毒载体将B7-1基因导入人胃癌细胞SGC-7901,G418阳性克隆筛选,流式细胞分析显示B7-1的表达;将携带B7-1基因的胃癌细胞(命名为SGC-7901/B7-1)接种于C57BL/6小鼠背部皮下,观测其致瘤性能;SGC-7901/B7-1致敏的小鼠对野生型瘤细胞是否具有免疫保护作用;用SGC-7901和SGC-7901/B7-1细胞分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞,MTT法检测其体外杀伤实验.结果 B7-1基因在胃癌细胞中获得高表达;SGC-7901/B7-1诱导的CTL(cytotoxic T lymphocyte)对SGC-7901的杀伤活性显著高于野生型SGC-7901诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活性(P＜0.05);SGC-7901/B7-1诱导的CTL对SGC-7901/B7-1的杀伤率显著高于对野生型SGC-7901的杀伤率(P＜0.05).结论 B7-1促进抗胃癌CTL的增殖、活化,能诱导抗胃癌主动免疫功能.
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共刺激分子CD80基因转染对肝癌细胞恶性表型的影响
目的观察转染了B7-1基因后肝癌细胞生物学特性的变化.方法通过逆转录病毒载体介导B7-1基因转入HepG2细胞,流式细胞仪(FCM)检测HepG2和HepG2/hB7-1细胞表面B7-1分子的表达水平,RT-PCR检测HepG2和HepG2/hB7-1细胞B7-1mRNA的水平.观察HepG2和HepG2/hB7-1细胞的生长曲线.结果 HepG2细胞表面B7-1分子表达水平低,其阳性率为3.66%.而HepG2/hB7-1的B7-1分子阳性表达率达到92.6%,转染B7-1基因后较转染前增大了28倍多.HepG2和HepG2/hB7-1的生长曲线相比,后者生长曲线上升减缓,生长速率减慢.结论 (1)HepG2表面B7-1分子的低水平表达是其弱免疫原性的主要原因.(2)逆转录病毒载体介导B7-1基因转染HepG2可以获得B7-1高表达的阳性克隆.(3)B7-1基因的转染可以降低肝癌细胞的恶性表型.
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B7-1基因转染对小鼠前胃癌细胞增殖活性的影响
目的观察B7-1基因转染对小鼠前胃癌细胞(MFC)增殖活性的影响.方法通过脂质体介导将B7-1基因转染MFC细胞,G418筛选阳性克隆后,用MTT法和流式细胞仪(FCM)分别测定转染然细胞增殖活性的变化,并以空载体pcDNA3转染MFC细胞作为对照.结果转染B7-1基因的MFC细胞增殖活性受到抑制.结论转染B7-1基因的MFC细胞增殖活性受到抑制,提示B7-1基因对MFC有免疫调节作用.
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表达人B7-1的重组腺病毒的制备及初步鉴定
目的 构建表达B7-1基因的重组腺病毒载体,制备相应的复制缺陷型重组腺病毒并检测其在喉癌细胞中的表达.方法 构建携带人B7-1基因的重组穿梭载体pAdtrack-B7-1,Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-B7-1.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株,RT-PCR检测感染细胞中B7-1基因mRNA表达.结果 酶切鉴定证实阳性pAdTrack B7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强.制备的Ad-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6d高水平的B7-1的表达,整体表达可持续两周.结论 成功构建了同时表达B7-1的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的B7-1基因,为进一步研究B7-1的功能及应用B7-1进行基因治疗奠定基础.
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B7-1基因修饰的肿瘤细胞瘤苗抗小鼠胃癌效应的实验研究
目的探讨B7-1基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗对小鼠胃癌的治疗效果.方法:在已建立高表达B7-1分子的小鼠前胃癌细胞系MFC-B7的基础上,观察MFC-B7细胞体外激活脾淋巴细胞的能力,体内成瘤性变化及作为瘤苗对荷瘤鼠胃癌的治疗效果.结果:MFC-B7细胞在体外能有效诱导脾淋巴细胞的活化增殖和特异性CTL(Cytotoxic T lymphocytes)活性的产生,在体内的成瘤能力明显下降,作为瘤苗接种对荷瘤鼠胃癌有较好的治疗效果.结论:B7-1基因修饰的肿瘤细胞免疫原性明显增强,有希望作为瘤苗用于此类肿瘤的治疗.
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B7-1和IL-12基因转染对肝癌细胞免疫原性的影响
目的观察B7-1和IL-12基因表达对人肝癌细胞免疫原性的影响.方法分别将B7-1和IL-12基因以逆转录病毒介导转染HepG2细胞.阳性克隆细胞与健康人外周血淋巴细胞(PBL)混合培养后,用流式细胞仪检测PBL表面Ⅰ类人白细胞抗原(HLA-Ⅰ)分子表达,以MTT法检测PBL的特异性杀伤活性及杀伤K562细胞的活性.结果混合培养后HepG2/B7-1和HepG2/IL-12细胞组PBL表面的HLA-Ⅰ分子表达分别较HepG2/neo细胞组增加16.95%和14.71%(P＜0.05); 与HepG2/neo组比较,HepG2/B7-1组PBL特异性杀伤活性增高12.5%(P＜0.05),HepG2/IL-12组PBL的特异性杀伤活性无明显增高(P＞0.05).HepG2/B7-1、HepG2/IL-12细胞活化的PBL对K562细胞的杀伤活性较HepG2/neo组分别增高19.38%和14.78%(P＜0.05).结论 B7-1和IL-12分子均能增强免疫细胞对肝癌细胞的识别和杀伤,从而有效增强肝癌细胞的免疫原性.
