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碱性磷酸酶的酶学性质研究及其在心肌标志物免疫检测中的应用
目的 研究不同缓冲溶液和添加剂(如NaN3和不同分子量的聚乙二醇)对碱性磷酸酶活性和稳定性的影响,并建立了心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和C-反应蛋白(CRP))的酶联免疫检测体系.方法 碱性磷酸酶的活性通常是用分光光度计法检测产物的生成量来计算.棋牌法建立cTnⅠ和CRP的酶联免疫检测体系.结果 缓冲溶液的种类、浓度和pH对酶反应产物的摩尔吸光系数和酶促反应速度有不同程度的影响.反应体系中加入NaN3(5～30 mM)和各种分子量的PEG(100 mg/ml)对酶活性没有显著影响,但不同分子量的聚乙二醇对酶均有一定的稳定化作用.结论 二乙醇胺(DEA)缓冲液对碱性磷酸酶有激活作用,NaN3和PEG对碱性磷酸酶没有显著影响.两种体系的检测性能良好,为该类试剂盒的开发提供有价值的信息.
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脂联素随原代HSC活化表达的动态变化及其对原代HSC表达MMP-13的影响
目的:探讨脂联素mRNA在原代肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化过程中表达的变化趋势,以及其对体外培养的原代HSC增殖状况和金属基质蛋白酶-13(MMP-13)mRNA与蛋白表达的影响.方法:改良的肝脏二步原位灌注法分离培养原代HSC;以α-SMA为原代HSC活化的标志,Real-time PCR方法检测随HSC活化脂联素表达的动态变化;MTT方法检测脂联素对活化HSC增殖的影响,以外源性脂联素处理原代HSC,根据脂联素浓度,分为对照组,脂联素处理浓度62.5μg/L,125μg/L,250μg/L,500μg/L五组,Real-time PCR方法检测MMP-13mRNA表达;ELISA方法检测原代HSC分泌的MMP-13蛋白量.结果:HSC存活率的下降与脂联素浓度呈线性相关(OR=0.828).MMP-13 mRNA和蛋白表达水平与外源性加入脂联素浓度正相关,当脂联素浓度增加至500 g/L时,MMP-13 mRNA表达增高至对照组的5.54倍,MMP-13含量增加至30.951μg/L显著高于对照组的24.127μg/L,差异具有显著统计学意义.结论:脂联素具有抑制肝纤维化的作用,其机制可能与抑制HSC增殖和增强MMP-13在HSC细胞的表达有关.
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抗体偶联药物研发中的生物分析
抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADCs)是一类单克隆抗体通过一段连接臂共价偶联细胞毒性小分子化合物而成的复合物,可以提高抗肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用.ADCs结构具有异质性并且其药物-抗体比值(drug-to-antibody ratio,DAR)在体内呈动态变化,其生物分析面临着巨大的挑战,常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应(ELISA)和液相色谱-质谱分析(LC-MS).ADCs同其他生物制品一样,在体内可能会产生抗药抗体(anti-therapeutic antibody,ATA),影响其药效、药动学及安全性,因此有必要评价其免疫原性.本文综述了在ADC研发过程中常见的基于ELISA和LC-MS方法的待测物分析,包括DAR分布、总抗体、结合型抗体、结合型药物、游离药物以及ATA分析,可为我国的ADCs研发提供参考.
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FQ-PCR法在丙型肝炎病毒检测中的价值研究
目的：研究探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在丙型肝炎病毒检测中的价值。方法90例进行丙型肝炎病毒检测的人员为研究对象，将其分别采用FQ-PCR法和酶联免疫吸附反应(ELISA)进行检测，然后将两种检测方法的检测结果进行比较。结果 FQ-PCR法的阳性率及阴性检测正确率均高于ELISA法，且特异性及敏感性均高于ELISA法，差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论 FQ-PCR法在丙型肝炎病毒检测中的价值相对较高，更适用于丙型肝炎病毒的检测。
关键词： 荧光定量聚合酶链反应 酶联免疫吸附反应 丙型肝炎病毒 检测 -
基因重组戊肝病毒多价复合抗原的表达及初步应用
目的:利用基因工程技术体外表达高效HEV多价复合抗原,建立一套敏感和特异的抗HEV检测体系.方法:将前期构建的基因重组戊肝病毒多价复合抗原表达质粒转化大肠埃希菌JM109,筛选鉴定阳性克隆并进行诱导表达,表达产物经分子筛层析纯化后,利用western blot作抗原特异性鉴定.以此抗原建立ELISA检测卫生部生物药品检定所HEV血清参比品及临床血清标本,同时以Genelab公司抗HEV ELISA试剂盒作为对照进行对比研究.结果:重组质粒转化大肠埃希菌JM109株后的阳性克隆,经诱导在SDS-PAGE中出现一条分子量大小约为31.5 kD的蛋白条带,该蛋白纯化后经Western Blotting检测证实为HEV特异性抗原.以此抗原包被酶联板建立ELISA检测53份国家卫生部标准HEV参比血清,灵敏度达100%(38/38),特异度达93.3%(14/15).用此方法检测68份临床标本,并与Genelab ELISA试剂盒结果比较,两者阴阳性相符的有64份,总符合率为94.1%.结论:本实验克隆表达的基因重组戊肝病毒多价复合抗原具有良好抗原性,以此抗原建立的抗HEV ELISA具有灵敏度高、特异性强的特点,可望为戊型肝炎的血清学诊断和流行病学调查提供一种更为有效的检测手段.
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蓝藻抗病毒蛋白-N在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备
目的:构建抗病毒蓝藻蛋白-N(Cyanovirin-N,CV-N)表达载体并在大肠杆菌中稳定表达,并进一步制备用于检测转CV-N基因表达产物的特异抗体.方法:以已构建的pMD(CV-N)为模板,设计引物,利用PCR技术扩增出CV-N基因,将成熟CV-N的编码框序列构建到原核表达载体pET-His中,氨苄青霉素平板筛选及PCR、酶切鉴定,挑选出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达.SDS-PAGE以及MALDI-TOF/MS分析鉴定,采用透析法重折叠复性,亲和层析分离纯化得到分子量为12 700的带有组氨酸标签的重组CV-N融合蛋白.用亲和层析分离纯化后的CV-N融合蛋白作为抗原,采用皮下多点注射免疫的方法免疫昆明小鼠,经过31天的免疫,获得抗CV-N的多克隆抗体.结果:成功地获得了CV-N基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,表达量高达42.0%.用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,测得抗体效价超过1∶8 000,Western blot检测结果显示,该抗体能特异性地与CV-N抗原产生明显免疫亲和反应.结论:建立原核高效稳定表达CV-N系统,获得具有生物学活性的CV-N蛋白,所制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性,为进一步研究其功能奠定基础.
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胸腺素α1抗体的制备和鉴定
制备用于检测转胸腺素基因蓝藻表达产物的特异性抗体 。方法：用提纯的小肽(28个氨基酸)胸腺素α1与牛血清白蛋白偶联后作 为抗原，采用皮下多点注射免疫的方法免疫大鼠。经过3个月的免疫，获得抗Tα的多克隆抗 体。结果：用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法，测得抗体效价超过4 096。蛋 白印迹(Western blot)检测结果显示，该抗体能特异性地与胸腺素α1抗原产生明显免疫亲 和反应。结论：所制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性。
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胸腺素α1抗体的制备及其效价测定
目的 制备用于检测胸腺素α1基因工程表达产物的特异性抗体.方法 以提纯的胸腺素α1与牛血清白蛋白偶联后作为抗原,皮下多点注射免疫大鼠.经过3个月的免疫,获得抗胸腺素α1的多克隆抗体.结果 用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,测定抗体效价超过5,000,显示该抗体能与胸腺素α1抗原特异性地产生明显免疫反应.结论 采用本法制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性.为胸腺素α1的分离纯化及大规模生产,从而为进一步满足临床需要奠定了基础.
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酶标法测定干扰素脂质体的包封率
目的 应用酶标法检测干扰素脂质体包封率.方法 应用ELISA法测定干扰素脂质体裂解前后的干扰素含量,计算脂质体的包封率,并与传统的Wish细胞病毒抑制法比较.结果 ELISA法在干扰素活性为104～107 IU/ml范围内,能检出的结果精密度明显高于传统Wish细胞病毒抑制法.Wish细胞病毒抑制法测定的3批样品包封率的CV值分别为8.6%、11.2%和12.70%,ELISA法测定的CV值分别为3.1%、4.3%和4.7%,二者差异有显著意义.结论 ELISA法可以快速、高通量、准确地检测干扰素脂质体的包封率.
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免疫学检测晚期氧化蛋白方法的建立及临床应用
晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPPs)是Witko-Sarsat在1996年提出的作为慢性肾功能衰竭(chrinoc renal failure,CRF)患者氧化应激和促炎症介质的标志[1],是CRF患者免疫功能紊乱、动脉粥样硬化性、透析相关性淀粉样变等CRF长期并发症发生过程中的重要致病环节[2].
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IFN-γ、IL-12对B7-1转染肝癌细胞诱导T淋巴细胞活化的影响
目的探讨B7-1基因转染肝癌细胞与IFN-γ、IL-12联合在体外诱导T细胞活化的能力.方法酶联免疫吸附反应(ELISA)检测联合诱导瘤苗刺激淋巴细胞IFN-γ、IL-12蛋白合成及细胞表面CD4、CD8、CD25的表达.MTT法检测瘤苗对淋巴细胞增殖作用的影响.结果HepG2/B7-1细胞诱导淋巴细胞表达IL-2、IFN-γ,其蛋白质含分别为875 pg/ml和1 246pg/ml;而联合IL-12、IFN-γ后能进一步诱导IL-2、IFN-γ的蛋白质合成,较各自无细胞因子组明显提高(P＜0.05).细胞表面CD4、CD8、CD25的表达显著增加.两者联合促进了淋巴细胞的增殖,在E/T=10:1时,较HepG2组明显增大.结论IL-12、IFN-γ增强经B7-1基因转染的肝癌细胞(HepG2/B7-1)诱导淋巴细胞产生IL-2、IFN-γ的能力;IL-12、IFN-γ可能通过调节B7-1分子的生物学活性影响其对T细胞的活化.
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肝癌患者唾液中丙型肝炎病毒抗体的检测
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)和原发性肝癌(PHC)的关系.方法采用酶联免疫吸附反应(ELISA)平行检测268例PHC患者唾液及血清中HCV抗体(抗-HCV),结果表明其检出率分别为14.55%(39/268)和15.29%(41/268).两种标本抗-HCV检测的阳性符合率为95.12%,阴性符合率100%.检测唾液中抗-HCV-lgG简便易行,安全可靠.结论 PHC患者唾液抗-HCV-lgG的检出,提示唾液可能成为丙肝感染途径之一,有助于PHC病因学、流行病学研究的深入开展.
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实时定量PCR和ELISA检测支原体感染在儿童肺炎诊断中的应用
目的 对比分析荧光实时定量PCR技术和ELISA技术在检测支原体肺炎中的可靠性和优劣性,探讨更加准确、快速的检测方法.方法 收集本院儿科治疗的呼吸道感染患者446例,根据年龄将患者分组.收集患者咽拭子用于实时定量PCR检测肺炎支原体DNA(MP-DNA),收集血液用于酶联免疫吸附实验(ELISA)检测肺炎支原体抗体(MP-IgM).结果 实时定量PCR技术检测MP-DNA总阳性率为37.00％,其中各年龄段阳性率分别为39.44％、37.31％、35.11％、28.95％,阳性检测率随年龄增加而降低;ELISA方法检测MP-IgM总阳性率为37.44％,其中各年龄段阳性率分别为18.89％、46.27％、50.00％、63.16％,阳性检测率随年龄增加而增加(P＜0.05),PCR方法婴儿组患者检出率明显高于血清ELISA方法.结论 2种方法检测MP阳性率差异无统计学意义,但实时定量PCR法在1岁以下的阳性检出率更高(P＜0.05),2种检测方法联合应用可更好地指导临床治疗.
关键词： 支原体 酶联免疫吸附反应 荧光定量聚合酶链反应 呼吸道感染 -
INHA基因的克隆表达以及多克隆抗体的制备
目的 INHA的表达、纯化,以及多克隆抗体的制备.方法 利用基因重组技术获得INHA基因以及去信号肽的INHA基因,将其都分别构建到原核表达系统并分离纯化得到相对分子质量为58 000的带有组氨酸标签的重组INHA融合蛋白.用分离纯化后的INHA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHA的多克隆抗体.结果 成功地获得INHA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法 ,Western blot检测结果 显示,该抗体能特异性地与INHA的抗原以及胎盘组织产生明显免疫亲和反应.结论 建立原核高效稳定INHA表达系统,获得具有生物学活性的蛋白,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础.
关键词： INHA抗体 克隆表达 酶联免疫吸附反应 Western blot -
21014 自身免疫性中性粒细胞减少症患儿血清粒细胞集落刺激因子水平并不增高[英]/Corbacioglu S…∥J Pediatr. -2000,137 (1). -96-99
自身免疫性中性粒细胞减少症(AIN)在婴儿的发病率为1/100000,高于先天性或获得性中性粒细胞减少症,由循环中抗中性粒细胞抗体导致网状内皮系统对外周血中性粒细胞破坏增多所致.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可调节造血细胞尤其是中性粒细胞的生成和分化,提高先天性、周期性及化疗所致中性粒细胞减少症的中性粒细胞数.研究者采用酶联免疫吸附反应(ELISA)和增殖试验检测G-CSF水平,以评估其在婴儿AIN的作用.
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非透析慢性肾病患者红细胞锌和碳酸酐酶水平
测定慢性非透析肾病患者红细胞内碳酸酐酶I、碳酸酐酶Ⅱ的浓度,并观察其与酸毒症、微量元素锌、贫血及补铁的关系. 用酶联免疫吸附反应法测定38名非透析肾病患者红细胞内碳酸酐酶的浓度,原子吸收分光光度法测定锌的浓度. 研究结果显示,患者体内碳酸酐酶水平升高,平均红细胞内锌浓度也升高,而血浆中锌浓度在临界值.碳酸酐酶I和红细胞锌呈显著正相关,与铁蛋白、pH值和重碳酸盐无显著相关.补铁后,碳酸酐酶水平不改变,但红细胞中锌降低.由此推测,慢性肾病患者红细胞中碳酸酐酶增加,但这不能被缺铁或酸毒症解释.
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对A72与PK15进行猪传染性胃肠炎血清中和试验的对比观察
[目的] 建立以狗直肠瘤(A72 细胞)进行TGEV血清中和试验的方法.[方法] 引进A72细胞系,建立成熟培养环境;以库存94份猪血清观察TGEV在A72与PK15中的增殖与病变,并采用ELISA试验进行验证.[结果] 以A72细胞培养增殖的TGEV毒价高于以PK15细胞培养增殖的TGEV毒价.在血清中和试验中A72病变明显,易于观察,较PK15细胞的人为误差小.[结论] A72细胞可以准确清晰地反应TGEV感染,其敏感性和准确性优于PK15细胞.
