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人型支原体实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立
目的 建立一种快速、灵敏和特异的人型支原体实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)检测技术.方法 依据人型支原体gap基因保守区域使用Beacon Designer 7.0软件设计引物和探针,建立人型支原体real-time PCR检测方法并优化.对优化后的方法进行实验室灵敏度、特异度和检测限评价,并与聚合酶链反应(PCR)进行比较.结果 该real-time PCR对于人型支原体的检测限为50 cfu,PCR检测限为5×103cfu,其检测灵敏度为PCR的100倍.所建立的检测方法对其他10种常见支原体、12种泌尿生殖道感染病原菌染色体及人类染色体的扩增均为阴性.结论 本研究建立的real-time PCR方法可灵敏、特异的检测人型支原体,有望用于临床标本检测.
关键词： 人型支原体 实时荧光聚合酶链反应 检测 -
乙型肝炎产妇乳汁中HBV DNA实时荧光-PCR检测及其意义
围生期传播是乙型肝炎的一条主要传播途径.由乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(+)母亲传播的小儿,95%以上在3月龄前后HBsAg已阳转,从乙型肝炎病毒(HBV)感染的潜伏期估计,围生期传播是婴儿HBV感染的重要方式.有关研究表明,新生儿的胃液中可检出HBsAg,发现胃液中的HBsAg与HBV感染密切相关;而婴儿的抗原血症与第一产程时间无关,剖宫产也不降低HBV的垂直传播率,认为可能经口摄入[1].因此,本研究探讨应用实时荧光聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清HBsAg(+)的产妇初乳中HBV DNA的价值.
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162例胃溃疡患者幽门螺杆菌感染情况及耐药性分析
目的:了解胃溃疡患者幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染情况及其耐药性,为临床胃溃疡诊断与治疗提供科学依据.方法采集罗定地区多家医院2009年2月至2011年11月162例临床确诊为胃溃疡患者胃窦部粘膜组织,制备的组织匀浆一部分进行荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)扩增检测幽门螺杆菌16SrRNA 基因,一部分进行幽门螺杆菌(Hp)培养、鉴定及琼脂稀释法药物敏感性试验.结果:162例胃溃疡患者进荧光定量聚合酶链反应证实幽门螺杆菌感染者96例,感染率为59.2%;经细菌培养鉴定证实幽门螺杆菌感染者92例,感染率为56.8%,两种方法检出相关性好,其相关系数为0.987.结论:实时荧光PCR技术是检测幽门螺杆菌快捷而可靠的方法.罗定地区胃溃疡患者选择呋喃唑酮+左氧氟沙星或左氧氟沙星+阿莫西林联合质子泵抑制剂进行根治幽门螺杆菌可能会取得较好的疗效.
关键词： 幽门螺杆菌 实时荧光聚合酶链反应 耐药性 -
畲族人群感染乙型肝炎病毒基因型及相关调查
目的:了解丽水地区畲族人群乙型肝炎病毒基因型的分布并比较本地区汉族人群感染该病毒基因型分布的差异,并进-步了解畲族人群乙型肝炎病毒感染者不同基因型对肝脏的损害程度以及乙肝血清标志物的表达.方法:用实时荧光PCR结合S基因测序的方法检测研究对象中HBV DNA阳性感染者,判定其基因型;运用全自动生化分析仪检测其肝功能指标ALT及AST;用酶联免疫吸附试验检测乙肝血清标志物.结果:共检测了1744份畲族标本,筛查到HBV DNA阳性173例,其中B型基因78例,C型基因92例,B/C混合型3例;B和C型中HBV DNA拷贝数的平均对数值分别为4.596±1.814和5.364±2.189;B和C型中转氨酶升高的分别为13和15例;B和C型中HBeAg阳性的分别为11和26例;平行检测了相当数量的本地区汉族人群作为对照.结论:丽水地区畲族人群感染HBV以B和C型为主,其中C型基因占的比例大于B型,与同一地区的汉族人群相比具有显著差异;就丽水地区畲族人群而言,B型感染者较C型感染者HBV DNA拷贝数低,HBeAg阳性率低,预示B型感染者较C型感染者的病毒活动性弱,肝脏损害轻,预后好.
关键词： 肝炎病毒 乙型 基因型 实时荧光聚合酶链反应 畲族 -
实时荧光PCR定量检测食品中单增李斯特菌
目的 建立快速、敏感、特异的食品中单增李斯特菌检测方法. 方法 针对单增李斯特菌溶素A基因(hlyA)设计一对引物和一条探针,并用该引物和探针运用实时荧光PCR技术对单增李斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行实时荧光PCR定量检测. 结果 利用实时荧光PCR技术,建立了DNA校正曲线、细胞校正曲线和质粒校正曲线,DNA校正曲线在1～32 CFU/ml、细胞校正曲线在32～320 CFU/ml、质粒校正曲线在1～37 Copies/ml.线形关系良好,且三种校正曲线检测样品得出的结果基本吻合. 结论 本试验建立起来的实时荧光PCR定量检测单增李斯特菌的方法灵敏度高、特异性好、准确,可应用于食品中单增李斯特菌的检测.
关键词： 利斯特菌 单核细胞增生 实时荧光聚合酶链反应 评价研究 食品 -
应用TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术检测鼠疫耶尔森菌
目的发展一种快速、敏感、特异的检测鼠疫耶尔森菌方法.方法应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因,pPCP1质粒上的pla基因,染色体上的与色素沉着相关的hms基因和侵袭素inv基因设计TaqMan引物探针,进行荧光定量PCR检验,评价方法的特异性、敏感性;构造并应用上述引物探针的外标对照定量;构造pla的内标对照,采用多重荧光定量PCR(FAM,VIC荧光检测),发现假阴性;采用UDG抗污染、ROX参照荧光染料矫正背景噪音,提高检验能力;检验模拟鼠疫耶尔森菌强毒株和EV菌感染的动物脾脏器样本,评价该法在实际工作的应用.结果设计的引物、探针特异性良好,pla、f1、hms指标的敏感性分别是低检出10拷贝、1拷贝、1拷贝.结论该方法能快速、灵敏、特异检出鼠疫耶尔森菌,对鼠疫监测、预防生物恐怖等方面具有重要意义.
关键词： 鼠疫耶尔森菌 实时荧光聚合酶链反应 定量分析 -
实时荧光PCR结合探针熔解曲线检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性及其与肝硬化的相关性研究
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)是当前常用的检测基因多态性的方法之一,该法不仅操作时间长,且在采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切后,通常采用溴乙锭或银染的方法观察结果.溴乙锭严重危害人体健康,而银染试剂相当不稳定.因此有必要建立一种快速且对人体危害性较低的多态性检测方法.实时荧光聚合酶链反应(PCR)是一种将先进的光学技术、温控技术、荧光素标记技术以及计算机软件有机结合的新型PCR,能够对PCR每一个循环的荧光强度进行监测,故称为实时荧光PCR.双探针杂交技术是一种重要的实时荧光PCR技术,通常用于基因的定量检测,但是如果结合探针熔解曲线则可用于基因多态性和突变的检测[1-3].
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成纤维细胞生长因子受体3基因荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立
慢性骨髓白血病、恶性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤等疾病均发现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的过量表达 [1,2].因此,FGFR3有可能作为病理检验和疗效评价的标志分子.目前国内尚无定量测定FGFR3表达水平的方法.本试验运用SYBR GreenⅠ实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法,建立了FGFR3基因的定量检测系统.为进一步FGFR3临床和基础研究作好了准备.报道如下.
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脂联素随原代HSC活化表达的动态变化及其对原代HSC表达MMP-13的影响
目的:探讨脂联素mRNA在原代肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化过程中表达的变化趋势,以及其对体外培养的原代HSC增殖状况和金属基质蛋白酶-13(MMP-13)mRNA与蛋白表达的影响.方法:改良的肝脏二步原位灌注法分离培养原代HSC;以α-SMA为原代HSC活化的标志,Real-time PCR方法检测随HSC活化脂联素表达的动态变化;MTT方法检测脂联素对活化HSC增殖的影响,以外源性脂联素处理原代HSC,根据脂联素浓度,分为对照组,脂联素处理浓度62.5μg/L,125μg/L,250μg/L,500μg/L五组,Real-time PCR方法检测MMP-13mRNA表达;ELISA方法检测原代HSC分泌的MMP-13蛋白量.结果:HSC存活率的下降与脂联素浓度呈线性相关(OR=0.828).MMP-13 mRNA和蛋白表达水平与外源性加入脂联素浓度正相关,当脂联素浓度增加至500 g/L时,MMP-13 mRNA表达增高至对照组的5.54倍,MMP-13含量增加至30.951μg/L显著高于对照组的24.127μg/L,差异具有显著统计学意义.结论:脂联素具有抑制肝纤维化的作用,其机制可能与抑制HSC增殖和增强MMP-13在HSC细胞的表达有关.
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WU多瘤病毒实时荧光聚合酶链检测方法的建立与应用
目的 建立快速、准确、特异的检测WU多瘤病毒的实时荧光聚合酶链反应方法.方法 根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理,以WU多瘤病毒VP2基因为靶序列,设计并合成引物和荧光探针;优化PCR反应条件,评价实时荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对394例临床样本进行检测.结果 成功建立了WU多瘤病毒的荧光定量PCR检测方法;该试验所建立的实时荧光PCR方法可准确、特异的检测WU多瘤病毒;该方法可定量检测1.0×100～1.0×107拷贝范嗣的WU多瘤病毒;检测的批间和批内的变异系数均<5.0%;394例患儿痰标本中共检测出3例人WU多瘤病毒阳性,阳性率为0.76%.结论 所建立的WU多瘤病毒荧光定量PCR法敏感性较高,重复性、特异性良好,适合于临床标本检测及大样本量筛查,可为临床诊断及流行病学研究奠定方法学基础.
关键词： WU多瘤病毒 实时荧光聚合酶链反应 检测 -
实时荧光聚合酶链反应检测解脲脲支原体的临床意义
目的 探讨实时荧光聚合酶链反应(PCR)在检测解脲脲支原体(Uu)中的临床意义.方法对278例未经治疗的门诊就诊者和35例确诊为Uu感染的患者经抗菌药物应用两周停药1周后分别采用实时荧光PCR和培养技术进行Uu的检测.结果 278例首次就诊者经实时荧光PCR检测Uu阳性125例,阳性率44.96%,培养阳性113例,阳性率40.65%,两者比较差异无统计学意义,35例确诊为Uu患者经抗菌药物治疗后停药1周,采用实时荧光PCR检测阳性12例,阳性率34.29%,但病原体含量要远远低于用药初期,35例患者经培养阳性5例,阳性率14.29%;两者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论实时荧光PCR在判断是否存在Uu感染时要较培养法灵敏,对经抗菌药物治疗停药后判断是否治愈时培养法要较荧光PCR更为准确.
关键词： 实时荧光聚合酶链反应 解脲脲支原体 培养 -
Per1和Per2基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立
Per1和Per2是时钟基因和抑癌基因,其异常表达与生物体昼夜节律紊乱和对癌症的易感性存在密切联系.与传统mRNA定量方法相比,SYBR Green I实时荧光聚合酶链反应具有简便、高效、成本低、准确性高、线性范围广的特点.本文建立了基于SYBR GreenⅠ实时荧光聚合酶链反应的Per1和Per2基因的定量检测系统,为进一步研究不同疾病状态下时钟基因和昼夜节律的变化打下基础.
关键词： Per1 Per2 实时荧光聚合酶链反应 -
P-糖蛋白编码基因mdr1在肝细胞癌中差异表达的定量检测
化疗药对于肝细胞癌(HCC)的疗效较差,有研究表明其与多种多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因有关[1],而多药耐药基因1(mdr1)的编码蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)在其中占有重要地位[2],本研究利用逆转录实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)技术定量检测了mdr1基因在肝细胞癌中的表达.
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光动力治疗对荷瘤裸鼠宫颈癌细胞杀伤作用下的SURVIVIN表达
目的:探讨光动力疗法(PDT)对宫颈恶性肿瘤杀伤作用的机制.方法:应用PDT对接种Me180宫颈癌细胞系的12只裸鼠做肿瘤杀伤的对比实验研究.通过实时荧光PCR对Survivin基因的相对定量分析,以明确基因表达水平的变化.并采用免疫组化SP法对凋亡抑制基因Survivin蛋白表达水平进行检测.结果:通过Survivin基因和蛋白表达的检测证实,治疗组mRNA及蛋白的表达较对照组显著降低(P＜0.01),PDT所致的细胞死亡与Survivin途径密切相关.结论:PDT治疗后Survivin基因和蛋白的表达均明显降低,Survivin可望成为评价PDT疗效的分子指标之一.
关键词： 光动力疗法 宫颈癌 免疫组化 实时荧光聚合酶链反应 裸鼠 -
实时荧光PCR在呼吸道感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的临床应用
目的 评价实时荧光PCR(RT-PCR)用于检测呼吸道感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的方法学特性,为临床快速诊断呼吸道MRSA定植或感染提供可靠循证依据.方法 通过RT-PCR技术对痰液标本中金黄色葡萄球菌(SA)特异性核酸酶编码基因nuc和MRSA的特异性耐药基因mecA进行定量检测,并同时以细菌培养、鉴定和MRSA耐药表型确诊实验作为参考方法,评价其灵敏度、特异度、阴阳性预测能力;用10倍梯度稀释法配制已知标准菌株菌悬液评估RT-PCR的低检出限.结果 RT-PCR法较细菌培养法对MRSA检测的总符合率为97.5％,检测SA的敏感度为97.2％、特异度为98.2％、阳性预测值为92.1％、阴性预测值为99.4％,检测甲氧西林耐药性的敏感度为100％、特异度为97.7％、阳性预测值为85.2％、阴性预测值为100％;RT-PCR对nuc基因和mecA基因的低检出限均为103/mL.结论 RT-PCR法与细菌培养法对于检测MRSA差异无统计学意义,且灵敏度优于后者,是用于临床快速排除性筛查呼吸道感染MRSA的较佳检测方法.
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实时荧光聚合酶链反应检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体的临床分析
采用实时荧光聚合酶链反应（PCR ）检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体，进行临床和实验室分析。采集380例男女性病患者泌尿生殖道分泌物，进行多形核白细胞数检测和荧光PCR。结果显示，216例男性患者中，尿道多形核白细胞数≥5个者占92．59％，荧光PCR检测沙眼衣原体阳性62例，阳性率为28．70％；沙眼衣原体合并淋病奈瑟菌感染30例，合并感染率为13．89％。164例女性患者中，87例宫颈管内多形核白细胞数≥10个（占53．05％），荧光PCR检测沙眼衣原体阳性33例（占20．12％）。结果提示，性病门诊开展实时荧光PCR检测沙眼衣原体可提高检测阳性率和控制沙眼衣原体传播。
关键词： 泌尿生殖道 沙眼衣原体 实时荧光聚合酶链反应 多形核白细胞 -
应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒
目的 比较实时荧光聚合酶链反应(PCR)与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)2种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法.方法 采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析.结果 实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77%,总一致性指数(Kappa指数)为0.538.其中,高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组二者的符合率为82%,Kappa指数为0.410,一致性比其他组好.结论 实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段.
关键词： 实时荧光聚合酶链反应 第2代杂交捕获法 人乳头瘤病毒 -
实时荧光PCR用于CYP2C19基因多态性检测的性能验证
目的 评价实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测细胞色素P450家族成员2C19(CYP2C19)基因多态性的精密度、准确度和检测限.方法 采用实时荧光PCR对基因型为*1/*1、*1/*2、*1/*3和*1/*17的DNA样本分别作批内重复扩增10次,以评价方法的精密度;比较实时荧光PCR与Sanger测序法的检测结果,以评价方法的准确性;对2倍梯度稀释的DNA样本(基因型为*1/*1、*1/*2、*1/*3和*1/*17)进行实时荧光PCR扩增,以评价方法的低检测限.结果 批内重复10次的分型检测结果完全一致,所有PCR的Ct值变异系数(CV)均<2.5％;实时荧光PCR的分型结果与Sanger测序法结果的符合率为100％(20/20),其中*1/*17型1例、*1/*1型3例、*1/*2型5例、*1/*3型5例、*2/*2型4例、*2/*3型2例;实时荧光PCR的低检测限为1.875 ng/μL DNA.结论 实时荧光PCR的基因分型结果稳定、可靠,适用于医学实验室CYP2C19基因多态性的检测.
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实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因表达
目的 建立检测肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)基因mRNA表达的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计特异性引物和TaqMan探针,以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为对照,建立检测TSLC1基因表达的实时荧光PCR方法,并采用细胞株和宫颈组织样本进行验证.结果 该方法检测TSLC1基因 mRNA的检测下限为每反应10个细胞或2拷贝cDNA, 总不精密度为3.1%.TSLC1基因mRNA在子宫肌瘤、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)与宫颈癌患者宫颈组织中的表达率分别为100%、75%、55%和24%.宫颈癌细胞株中未检出TSLC1基因mRNA表达.所有样本中均有GAPDH基因mRNA表达.结论 该实时荧光PCR方法能够有效检测TSLC1基因mRNA表达,是进一步研究TSLC1基因在宫颈癌发生中的作用及宫颈癌早期诊断的重要工具.
关键词： 实时荧光聚合酶链反应 TSLC1基因 宫颈癌 -
实时荧光PCR与COBAS Amplicor PCR-ELISA 定量检测血清HBV DNA的比较
目的 研究实时荧光聚合酶链反应(PCR)与COBAS Amplicor PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测血清标本中乙型肝炎病毒(HBV)DNA水平的相关性.方法 采用实时荧光定量PCR与COBAS Amplicor PCR-ELISA平行检测110例HBV携带者和40名健康体检者的血清标本,比较2种方法检测结果的相关性和差异程度.结果 实时荧光PCR与COBAS Amplicor PCR-ELISA定量检测血清HBV DNA相关性较好,相关系数为0.944,对高浓度标本检测结果的差异性更小.结论 我们采用的实时荧光PCR检测血清标本HBV DNA与COBAS Amplicor PCR-ELISA具有较好的相关性,可以为临床提供可靠的结果.
关键词： 乙型肝炎病毒 实时荧光聚合酶链反应 定量 血清
