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受人E2F1启动子调控的条件复制型腺病毒载体的构建与鉴定
目的 构建并鉴定受人E2F1基因启动子调控的条件复制型腺病毒载体.方法 以人胚肾293细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增E2F1基因启动子调控序列,构建表达质粒pE2F1 p-EGFP;PCR扩增腺病毒早期基因E1A,构建表达质粒pTERT p-E1A;将重组质粒pTERT p-E1A酶切得到的E1A基因,插入线性化的pE2F1 p-EGFP,构建pE2F1 p-E1A;酶切重组质粒pE2F1 p-E1A产生受E2F1基因启动子调控E1A的完整表达框,插入质粒pDC311中,构建腺病毒包装穿梭质粒pDC311-E2F1 p-E1A,与腺病毒骨架质粒pBHGlox△1,3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制型腺病毒Ad-E2F1 p-E1A;扩增病毒并分别感染E2F1活性增强的系列肿瘤细胞株,利用病毒空斑形成实验检测重组条件复制型病毒的条件复制能力.结果 限制性内切酶鉴定显示重组质粒构建成功,受人E2F1基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体仅在E2F1活性增强的肿瘤细胞株中实现条件性复制.结论 构建的新型条件复制型腺病毒载体具有良好的选择性复制能力,在E2F1活性增强的肿瘤治疗方面有良好的应用前景.
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携带TRAIL基因的条件复制型腺病毒载体的构建及其辐射诱导表达
目的：构建携带早期生长反应基因-1（Egr-1）启动子和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）基因的条件复制型腺病毒载体 pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K，观察其联合2.0 Gy X射线照射对人乳腺癌 MDA-MB-231细胞 TRAIL 表达的影响。方法：以 pMD18T-Egr1为模板，成功克隆Egr-1序列，将TRAIL基因置于下游，构建条件复制型腺病毒载体 pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1 A-E1 Bp-E1B55K （CRAd.pEgr1-TRAIL），病毒包装后感染细胞，给予 X 线照射，利用 Real time PCR 法检测TRAIL mRNA 表达水平，ELISA法检测 TRAIL蛋白表达水平。实验设对照（control）组、2 Gy组、空病毒（CRAd.p）组、CRAd.p ＋2 Gy组、CRAd.p-Egr1-TRAIL组和CRAd.p-Egr1-TRAIL ＋2 Gy组。结果：成功构建 pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K，并进行了病毒包装。以病毒滴度5感染复数（MOI）感染MDA-MB-231细胞24 h后给予2.0 Gy X射线照射，4 h后MDA-MB-231各组细胞中TRAIL mRNA表达水平开始升高，8 h后各组表达达峰值；CRAd.pEgr1-TRAIL＋2.0 Gy组mRNA表达水平升高为明显，约为对照组的160倍（P＜0.01），随后表达水平逐渐下降；6 h后各组 MDA-MB-231细胞中 TRAIL蛋白表达水平开始升高，24 h后各组TRAIL蛋白表达水平达峰值，48 h后TRAIL蛋白表达水平下降，但仍未降至正常水平；与其他各组比较，CRAd.pEgr1-TRAIL ＋2.0 Gy组TRAIL蛋白表达水平升高明显（P＜0.01）。结论：成功获得条件复制型腺病毒载体，联合2.0 Gy X射线照射可使 MDA-MB-231细胞中 TRAIL mRNA和蛋白表达水平升高。
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腺病毒提高腺相关病毒在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达及其机制
目的: 研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制.方法: rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒(Ad5-RFP)或条件复制型腺病毒(Ad5-TERT-RFP)感染人非小细胞肺癌细胞系(NCI-H446)、人肺腺癌细胞系(A549)、人胃癌细胞系(SGC7901)、人口腔黏膜上皮癌细胞系(KB)和人口腔黏膜上皮癌耐长春新碱细胞系(KB/VCR).荧光显微镜观察和流式细胞仪分析肿瘤细胞感染后GFP的表达;Western blotting检测感染后肿瘤细胞GFP蛋白表达及ERK和AKT磷酸化水平;Real-time PCR检测肿瘤细胞内GFP的mRNA表达量、DNA拷贝数,以及细胞表面受体HSPG、αv integrin和FGFR-1的mRNA表达.结果: 流式细胞结果显示,rAAV2-GFP联合Ad5-RFP或Ad-TERT-RFP感染肿瘤细胞24 h后,GFP阳性细胞率和GFP平均荧光亮度分别提高了约0.3～3倍和4～8倍.Western blotting证实联合应用Ad5-RFP感染肿瘤细胞后24 h,GFP蛋白表达增加约4～6倍,肿瘤细胞内ERK和AKT磷酸化水平升高.联合感染后细胞内GFP的mRNA表达量提高了3.83～7.33倍,DNA拷贝数未见明显改变,HSPG、αv integrin和FGFR-1的mRNA表达轻微提高.结论: 低剂量腺病毒显著提高rAAV2在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达水平,可能与激活信号传导通路、增加细胞内转录有关.
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含Survivin启动子条件复制型腺病毒的构建及其对前列腺癌抑瘤效应的体外研究
目的:构建携带有Survivin启动子和报告基因的条件复制型腺病毒并观察该病毒对前列腺癌细胞的特异性溶瘤作用.方法:以前列腺癌细胞系LNCaP细胞全基因组DAN为模板,PCR扩增Survivin启动子,构建pGL3BSurvivin质粒表达载体,荧光素酶检测系统观察前列腺癌细胞中Survivin启动子活性.将pGL3BSurvivin亚克隆至穿梭质粒pShuttle中,构建含有Survivin启动子的重组腺病毒reADGL3BSurvivin.转染HEK293细胞进行重组病毒的扩增、纯化和滴度检测.利用CCK-8法检测重组腺病毒对前列腺癌细胞的生长抑制作用,以正常前列腺细胞为对照.结果:经多种限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定,证实成功构建了含Survivin启动子报告基因质粒表达载体.荧光素酶报告基因检测结果表明前列腺癌细胞内Survivin启动子活性明显高于正常细胞组.同时也证实成功构建了含Survivin启动子和报告基因的腺病毒载体；CCK-8结果显示reADGL3BSurvivin可有效抑制前列腺癌细胞增殖而对正常细胞无增殖抑制作用.结论:成功构建含Survivin启动子的条件复制型腺病毒具有选择性杀伤前列腺癌细胞的能力,实验结果为前列腺癌靶向治疗提供了良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略.
关键词： 前列腺肿瘤 Survivin启动子 条件复制型腺病毒 -
PTEN增强溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用
目的 研究由survivin启动子调控、携带抑癌基因PTEN的条件复制型重组腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用.方法 构建含有survivin启动子和PTEN基因的重组腺病毒reADGL3BSurvPTEN,感染前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞系.利用Western blot检测病毒感染前后前列腺癌细胞中PTEN的表达变化,CCK-8法及流式细胞学检测重组腺病毒对前列腺癌细胞生长及凋亡的影响.结果 PCR结果证实成功构建了含有survivin启动子和PTEN基因的腺病毒载体reADGL3BSurvPTEN,Western blot 结果显示感染ADGL3BSurvPTEN后在高表达survivin的前列腺癌细胞中PTEN表达明显增高,而在不表达survivin的正常前列腺细胞中,仅检测到内源性PTEN的表达.CCK-8法及流式细胞术结果表明reADGL3BSurvPTEN病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用较不含PTEN基因的腺病毒reADGL3Bsurvivin更加明显,对正常前列腺上皮细胞没有显著的杀伤作用.结论 成功构建了含有survivin启动子和PTEN基因的条件复制型腺病毒,该病毒对前列腺癌细胞有显著的杀伤作用,实验结果为前列腺癌细胞靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略.
关键词： Survivin启动子 PTEN 条件复制型腺病毒 前列腺癌 -
CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用
目的：构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP，探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法：PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒pDC316-GFP，将骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre和重组质粒pDC316-CXCR4-GFP共转染293细胞，产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增，扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定；real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达，筛选出表达高的A549细胞；将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞，检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数；将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，CCK-8检测各组细胞活性。结果：成功构建重组质粒pDC316-CXCR4-GFP，与骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光；PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中；测定重组腺病毒滴度为1×1013 PFU／L；CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升；与Ad-NULL组和空白对照组相比，CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异，第5天细胞凋亡率明显增加，细胞活性明显降低，各组间5 d内16 HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论：成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP，该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。
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双重靶向条件复制型腺病毒的包装及抗肿瘤作用
目的 构建并包装以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控E1A(CR2区缺失)蛋白表达的肿瘤细胞双重靶向条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd),并探讨其对肿瘤细胞的抑制作用.方法 采用PCR技术扩增hTERT启动子序列,将其克隆至pShuttle-E1A-E1Bp-E1B55K载体(E1A基因CR2区缺失)中,构建重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞进行病毒包装,PCR鉴定;CCK-8法检测重组腺病毒(CRAd.p-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,简称CRAd.p)对肿瘤细胞的抑制作用.结果 hTERT启动子序列克隆正确;pShuttle-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K经Kpn Ⅰ单酶切可见1 542 bp和6 775 bp两条电泳带,PCR鉴定得到250、1 148 bp和298 bp基因片段;CRAd.p经PCR扩增得到250、1148 bp和298 bp基因片段,鉴定结果与预期完全相符;CRAd.p感染MCF-7、MDA-MB-231、HepG2和HTC-8细胞72 h后与各自对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);CRAd.p感染MDA-MB-231细胞后10～250 MOI组细胞吸光度值与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),随着感染时间延长,抑制作用越发明显.结论 成功获得对肿瘤细胞具有双重靶向和溶瘤作用的条件复制型腺病毒,为基因治疗的靶向性和有效性提供了可能.
