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应用重组抗原诊断弓形虫病的研究进展
随着分子生物学的发展，对弓形虫重组抗原的研究取得了一系列的进展，多种弓形虫抗原基因通过基因工程手段得以表达并应用于弓形虫防治研究，这些抗原包括膜表面抗原（surface antigen，SAGs）、致密颗粒蛋白（dense granule proteins， GRAs）、棒状颗粒蛋白（rhoptry proteins，ROPs）、微线体蛋白（microneme proteins，MICs）以及基质抗原等［1］。重组抗原在弓形虫病诊断方面的研究一直存在两个方面，一方面是针对每一种抗原进行单独研究以确定其免疫特性，是筛选高效诊断抗原的主要途径，同时对于弓形虫感染机制等方面的研究也有重要意义；另一方面是针对复合抗原的研究以期望克服单一抗原在免疫诊断中的不足，优化得到佳的抗原组合，达到佳的诊断结果。当前人们对于弓形虫重组抗原的研究主要集中于两个方向，一是利用抗原性进行弓形虫免疫学检测，二是利用免疫原性用作疫苗进行免疫保护，本文就弓形虫重组抗原在弓形虫免疫诊断中的新研究进展做一综述。
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抗猪IgM单克隆抗体的研制
随着规模化养猪业的发展,我国已相继出现多种新的猪传染病,包括猪繁殖与呼吸综合征、副猪嗜血杆菌和猪圆环病毒Ⅱ型感染等[1-3],并已引起严重的经济损失.研制抗猪IgM单抗来检测这些疫病特异性IgM型抗体,将为该疾病早期诊断提供新且简便的途径.近年来研究发现抗原特异性B细胞有高效抗原递呈作用[4],其膜表面抗原受体对抗原的摄取、浓缩和处理起着重要作用.用抗猪IgM μ链McAbs和抗体-抗原的McAbs组成的双特异性抗体,既能与抗原特异性结合,又能与B细胞膜表面抗原结合,从而能进一步在体内外从分子水平上研究B细胞抗原递呈特点,并且为显著降低疫苗接种剂量,提高机体免疫能力的探索提供新的实验手段.鉴此,本实验室用PEG融合技术,研制出分泌抗猪IgMμ链McAbs杂交瘤细胞株.
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弓形虫膜表面抗原SAG1基因的原核表达及重组蛋白的免疫诊断价值
目的 探讨重组弓形虫膜表面抗原SAG1基因的表达产物-原核表达蛋白(rSAG1)用于弓形虫病的免疫诊断价值.方法 用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌重组质粒pET28a-SAG1(pET28a-SAG1/BL21)表达,纯化重组pET28a-SAG1/BL21弓形虫膜表面抗原SAG1基因表达产物;用弓形虫缓殖子感染的鼠血清、正常鼠血清和10例弓形虫患者血清为一抗,基因表达产物rSAG1用免疫印迹法进行鉴定,比较rSAG1在弓形虫病免疫诊断中的价值.结果 纯化重组弓形虫膜表面抗原SAG1基因后获得了相对分子质量约38.5×103的表达产物rSAG1;表面抗原SAG1可被弓形虫缓殖子感染的鼠血清所识别;10例弓形虫患者血清在免疫印迹诊断中,有4例出现了弓形虫膜表面抗原SAG1基因表达产物rSAG1.结论 rSAG1具备一定的弓形虫病的免疫诊断价值.
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凋亡相关分子Fas和FasL在自身免疫性甲状腺炎发病中的作用
桥本甲状腺炎和毒性弥慢性甲状腺肿是两种病理表现不同的器官特异性自身免疫性疾病.有资料显示,桥本甲状腺炎的病理切片上凋亡小体增多,而毒性弥漫性甲状腺肿凋亡小体很少[1].但迄今为止,对凋亡相关分子Fas和FasL在甲状腺上皮细胞的表达情况仍有争论[2,3].导致争论的原因主要为所选抗体与所用方法不相匹配,市售抗人FasL的抗体有很多种,单克隆抗体有NOK-1、NOK-2、NOK-3、mAb-33、G247-4,多克隆抗体有Q-20、C-20、N-20,所采用的研究方法有免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、流式细胞术、蛋白质杂交法.每一种研究方法必需选择相匹配的抗体.有些研究者还指出,C-20和mAb-33不是特异性与细胞膜表面的FasL相结合,它们还能与其他膜表面抗原相结合.本研究即是在充分考虑并排除这些因素后研究Fas和FasL在自身免疫性甲状腺炎发病中的作用.
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弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
目的体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因,构建原核表达质粒,并表达SAG1编码基因序列.方法收集、纯化RH株速殖子,提取RNA,据已知的SAG1基因序列,在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点.应用RT-PCR技术,扩增SAG1基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定,转化宿主菌BL21,并以IPTG诱导表达.结果从弓形虫RH株RNA中扩增出1 011 bp的SAG1基因片段,构建重组质粒pET28a/SAG1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符;IPTG诱导,SDS-PAGE显示表达产物的大小约34.8 kD.结论成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因,构建了pET28a/SAG1重组质粒并获得了高效表达,为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件.
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查菲埃立克体重组120kDa抗原的初步应用研究
目的克隆查菲埃立克体120kDa膜表面抗原蛋白基因,获得纯化的重组蛋白.方法根据查菲埃立克体(91HE17)120kDa抗原蛋白基因序列设计特异性引物,PCR扩增查菲埃立克体120kDa抗原蛋白的基因片段;用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后与pUC18载体相连接,经酶切和序列分析证实后,将目标片段定向插入原核表达载体pProEX HTB中构建pProEX HTB/p120重组质粒;将重组质粒转化E.coli DH5α,并使转化子在IPTG的诱导下进行蛋白质表达;运用亲和层析和电洗脱法对重组蛋白进行纯化.结果克隆到一大小为1080bp的查菲埃立克体120kDa抗原蛋白的基因片段,用该基因与表达质粒连接,成功构建了重组表达质粒;SDS-PAGE分析显示:在IPTG诱导下,重组表达质粒转化的大肠杆菌产生一分子量为47kDa的目标蛋白,免疫印迹证明该重组蛋白能与查菲埃立克体免疫血清发生反应.用纯化的重组蛋白作免疫斑点分析,76份被检血清中有2份为可疑阳性,但经IFA复核为阴性.结论查菲埃立克体120kDa重组抗原蛋白具有免疫反应活性,为以重组蛋白为基础的人单核细胞埃立克体病的血清学诊断试剂盒制备和疫苗的研制奠定了基础.
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弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定
克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.
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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
