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柯萨奇病毒 B3感染人宫颈癌细胞株 HeLa细胞后 Bad mRNA 表达的意义
目的：探讨柯萨奇病毒 B3（CVB3）诱导的 Bad mRNA 表达的意义。方法体外培养的HeLa 细胞通过 CVB3感染建立模型，通过倒置显微镜下观察 CVB3感染 HeLa 细胞后在不同时间点（3 h、6 h、9 h、12 h、24 h）细胞形态学变化，采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测凋亡相关基因Bad mRNA 的表达。采用 SPSS 16．0统计软件进行统计分析，两组 Bad mRNA 的表达水平采用均数±标准差表示，显著性比较采用 t 检验。结果 CVB3感染 HeLa 细胞后对照组各时间点无形态上的变化；病毒组随着感染时间的延长，逐渐出现细胞病变效应，以感染24 h 后明显。对照组各时间点Bad mRNA 的表达量比较差异无统计学意义（P＞0．05），病毒组各时间点 Bad mRNA 的表达量比较差异无统计学意义（P ＞0．05），但感染24 h 后病毒组 Bad mRNA[（0．61±0．06）s]表达低于对照组[（0．76±0．06）s]，差异有统计学意义（t ＝－3．445，P＜0．05），而3 h、6 h、9 h、12 h 后病毒组和对照组 Bad mRNA 表达量的比较差异无统计学意义（t＝－0．97，－0．43，－3．9，－0．97；P＞0．05）。结论促凋亡基因 Bad mRNA 在 CVB3病毒感染的 HeLa 细胞中发挥促凋亡作用。
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重组腺病毒载体介导的基因治疗及其与放射治疗联合应用对子宫颈癌HeLa细胞的作用
目的观察重组腺病毒载体(Ad)介导的野生型p53基因(Ad-p53)单独及与放射治疗(放疗)联合应用(联用)对宫颈癌HeLa细胞的体内、外作用效果.方法将Ad-p53单独或与放疗联用,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术证实转染的成功性;通过细胞生长和存活的抑制实验、流式细胞仪分析、梯状DNA(DNA ladder)实验,以及裸鼠皮下移植瘤的治疗实验,观察Ad-p53对宫颈癌HeLa细胞的体内、外作用及可能作用机制.结果 RT-PCR技术检测结果显示,加入Ad-p53后,p53 mRNA表达明显增加.在体外实验中,Ad-p53对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制率为61.8%,单独放疗的抑制率为44.6%,而Ad-p53与放疗联用的抑制率为85.5%,后者分别与前两者比较,差异均有显著性(P<0.05).在体内实验中,单独Ad-p53与放疗对HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为54.8%和58.4%,而Ad-p53与放疗联用的抑瘤率达到77.4%,后者分别与前两者比较,差异均有显著性(P<0.05).结论 Ad-p53在体内、外对宫颈癌HeLa细胞生长均有明显的抑制作用,而将其与放疗联用则抑制作用更明显.作用机理可能与Ad-p53诱导细胞凋亡和引起细胞G2～M期的阻滞作用有关.
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维甲酸对 HeLa 细胞间隙连接蛋白 43信号转导途径的调控作用
应用特异性钙指示剂 Fluo-3 AM 在激光扫描共聚焦显微镜下动态观察维甲酸作用后细胞胞质内信号转导分子游离钙的分布及强度变化，以FCM、Western blot法检测 Cx43 蛋白表达及蛋白酪氨酸磷酸化状态的改变。结果发现维甲酸作用后HeLa 细胞内游离钙浓度明显增加， i 由静息状态下的 35.73 nmol/L上升至 58.16 nmol/L；Cx43蛋白阳性细胞计数率由1.9 %上升至 26.3 %；HeLa 细胞出现Cx43 蛋白酪氨酸磷酸化。提示 HeLa 细胞Cx43 信号转导途径是在外源信号刺激下，在胞质内 i 的参与下，Cx43 蛋白表达上调，并在酪氨酸位点出现明显的磷酸化。维甲酸通过对与生长抑制相关的 Cx 基因信号转导途径的调节，实现对肿瘤生长的抑制作用。
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丹参注射液体外促进宫颈癌细胞增殖的调控分子表达分析
目的：分析丹参（SMB）注射液对宫颈癌细胞的促增殖效应及其相关调控分子表达的影响。方法将人宫颈癌Hela 细胞分别与终浓度为1．56 g／L、3．13 g／L、6．25 g／L、12．50 g／L、25．00 g／L、50．00 g／L、100．00 g／L、200．00 g／L 的 SMB 共同孵育，噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长增殖的 A492值，流式细胞计数（FCM）分析细胞周期各时相细胞百分率及凋亡指数（AI）、增殖指数（PI）；免疫细胞化学染色显示 PCNA、Bcl-2、Bax 分子表达水平，计算表达阳性细胞百分率，并以图像分析系统定量分析阳性表达强度。结果12．50～200．00 g／L 的 SMB 作用后，Hela 细胞的生长增殖呈递进性显著增高（均 P ＜0．05），且与 SMB 浓度间呈显著正相关（P ＜0．01）；Hela 细胞 G0／G1期比例显著降低，S、G2／M期比例及 PI 值显著升高（均 P ＜0．05），AI 值变化无显著差异（P ＞0．05）。同时，Hela 细胞中 PCNA、Bcl-2的阳性表达率及表达强度明显增高，Bax 的阳性表达率及表达强度明显降低，其变化均与 SMB 作用浓度呈显著相关关系。结论 SMB 注射液可影响 Hela 细胞增殖凋亡调控分子的表达，发挥促增殖效应，在疾病治疗应用中须慎重。
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刺五加注射液对 Hela 细胞抑制作用的实验研究
目的:探讨刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela体外增殖的抑制作用.方法:采用MTT法测定了不同浓度的刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela的体外抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态变化.结果:刺五加注射液浓度越高对Hela细胞抑制作用越好,作用时间越长抑制效果越强,量效关系和时效关系良好;形态学观察到细胞凋亡.结论:刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela的细胞增殖有较强的抑制作用.
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组织因子途径抑制物－2在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响
目的：观察组织因子途径抑制物（TFPI）－2在正常宫颈、宫颈上皮内肿瘤（CIN）和宫颈鳞癌组织中表达的差异及 TFPI－2对体外培养的宫颈癌 Hela 细胞增殖和凋亡的影响。方法收集2009～2010年在该院妇产科住院治疗的68例宫颈鳞癌患者，48例 CIN 患者及12例宫颈正常患者的宫颈组织标本，免疫组化染色检测宫颈组织中 TFPI－2的表达。取生长状态良好的宫颈癌 Hela 细胞，应用基因转染的方法建立 TFPI－2高表达细胞系，Real－time PCR 和 Western 印迹方法检测基因转染前后细胞中 TFPI－2 mRNA 和蛋白的表达；四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测各组细胞的增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果①免疫组化染色显示，正常宫颈组织、CIN 和宫颈癌中 TFPI－2表达逐渐降低，三者间比较差异有统计学意义（P＜0．01）。②体外观察发现，转染 pcDNA3．1－TFPI－2的 Hela－TFPI－2组细胞 TFPI－2 mRNA 和蛋白表达明显高于转染空白质粒组和空白对照组（P＜0．01）；MTT 结果显示，Hela－TFPI－2组细胞增殖速度明显低于空白对照组和空白质粒组，且随着培养时间的延长，这种抑制作用更明显（P＜0．05）；流式细胞仪检测结果显示 Hela－TFPI－2组细胞凋亡率显著高于空白对照组和空白质粒组（ P＜0．05）。结论 TFPI－2表达随着宫颈病变的进展逐渐降低；同时过表达的 TFPI－2可明显抑制宫颈癌 Hela 细胞增殖，促进其凋亡。提示 TFPI－2的表达减少可能是宫颈癌发生发展的机制之一，TFPI－2可能是治疗宫颈癌的新靶点。
关键词： 宫颈癌 组织因子途径抑制物-2 HeLa 细胞 细胞增殖 凋亡 -
胡桃醌联合顺铂对宫颈癌 HeLa 细胞的促凋亡作用及其机制
目的：探讨胡桃醌与顺铂联合应用对宫颈癌 HeLa 细胞促凋亡作用的机制，阐明其对相关信号转导通路的作用。方法：选取处于对数生长期的 HeLa 细胞，将其分为对照组、胡桃醌组、顺铂组和胡桃醌＋顺铂组（联合用药组）。采用 MTT 法观察不同时间点 HeLa 细胞的增殖抑制率；Hoechst 33258染色法荧光显微镜下观察细胞凋亡形态；Western blotting 法检测各组细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 和 caspase-3及 PI3K／AKt 通路中AKt 和 pAKt 表达水平。结果：MTT 法，各用药组 HeLa 细胞增殖于24、48和72 h 均可被抑制，与对照组比较，胡桃醌组及顺铂组对细胞的抑制较明显，而联合用药组抑制更加显著；与单用药组比较，联合用药组对细胞的抑制更显著。Hoechst 33258染色，胡桃醌组和顺铂组在处理细胞12 h 后，出现明显的凋亡细胞形态，联合用药组该现象更明显。Western blotting 检测，与对照组比较，12 h 后胡桃醌组和顺铂组 HeLa 细胞中 Bcl-2和pAKt 蛋白表达水平明显降低，而 Bax、Cleave-caspase-3和 AKt 蛋白表达水平明显升高，联合用药组上述变化更加明显。结论：胡桃醌和顺铂联合应用可通过抑制 PI3K／AKt 通路，进而促进 HeLa 细胞凋亡。
关键词： 胡桃醌 顺铂 PI3K/AKt 信号转导通路 细胞凋亡 HeLa 细胞 -
协同抑制Ku80和DNA—PKcs对HeLa细胞放射生物学功能的影响
目的:研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和LY29400抑制单个或多个DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)修复蛋白后,HeLa细胞放射敏感性和细胞周期的变化.方法:Ku80受抑细胞HeLa/Ku80-siRNA和对照细胞HeLa/Neg-siRNA分别转染可以靶向抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)表达的siRNA.或用DNA-PKcs活性抑制剂LY294002处理,经6 MV X线照射后,克隆形成实验检测细胞放射敏感性的变化,FCM法检测细胞周期.结果:DNA-PKcs-siRNA转染后的HeLa/Ku80-siRNA细胞,其2 Gy照射后的存活分数(sur-vival fraction,SF2)为0.08±0.01,LY294002作用后HeLa/Ku80-siRNA的SF2达0.03±0.01,均远低于未处理HeLa/Ku80-siRNA细胞的0.20±0.05.各组细胞照射6 Gy后均出现G2/M期阻滞,转染DNA-PKcs-siRNA的HeLa/Neg-siRNA细胞以及经LY294002处理的HeLa/Ku80-siRNA、HeLa/Neg-siRNA细胞G2/M期阻滞逐渐缓慢出现,照射后72 h仍末达到顶点,而其他细胞G2/M期阻滞均于照射后48 h达到顶点.结论:在抑制Ku80已达95%的基础上,DSB修复功能可以由其他DSB修复蛋白如DNA-PKcs和共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant,ATM)代偿,协同抑制上述蛋白可以明显增加,如HeLa细胞的辐射敏感性;Ku80、DNA-PKcs和ATM在细胞的G2/M期阻滞过程中发挥的作用不同.
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尖吻蝮蛇蛇毒对刚地弓形虫侵入宿主细胞的作用研究
目的观察细胞培养系统中宿主细胞在不同剂量源自皖南地区的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的作用下感染刚地弓形虫速殖子百分率的差异;探讨运用蝮蛇蛇毒作为辅助因子提高细胞培养用于弓形虫病病原学诊断的敏感性.方法以尖吻蝮蛇蛇毒加入分孔培养的Hela细胞和THP-1细胞中,分别用IFA和流式细胞仪进行检测,观察尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的影响.结果在相同的时间内,在尖吻蝮蛇蛇毒的作用下,Hela细胞和THP-1细胞感染弓形虫速殖子的百分率在不同的时段均明显的提高.结论尖吻蝮蛇蛇毒可以促进弓形虫速殖子侵入宿主细胞,在实际应中,可以作为一种辅助因子在检测标本时提高速殖子检出率,有利于缩短弓形虫的检出时间.
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TACE基因shRNA真核表达载体的构建及其对HeLa细胞生物学活性的影响
目的 构建靶向肿瘤坏死因子转换酶(TACE)的小发夹结构 RNA(shRNA)的真核表达载体,观察干扰TA-CE 表达对 HeLa 细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计针对 TACE 基因的 4 个 shRNA 序列,构建真核表达载体 shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4.通过酶切和测序等方法进行鉴定.转染 HeLa 细胞后,用 Reahime PCR 的方法检测其对 HeLa 细胞 TACE 基因表达的影响;用ELISA检测细胞分泌的 sTNF-α,间接反映干扰 TACE 的效果;用 MTT 法检测细胞增殖活性;用 DNA ladder 和流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建和筛选出了针对 TACE 基因的 3 个有效的特异性真核表达载体,且均在不同程度上抑制了 HeLa 细胞 TACE 基因的表达.ELISA 检测结果与 Reahime PCR实验结果相符.同时发现干扰 TACE 基因后,HeLa 细胞的生长受到抑制,凋亡率升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05).实验组转染 shRNA1～3 后 72 h 可见特征性的基因组 DNA ladder 条带.结论 所构建的TACE shR-NA 真核表达载体能显著抑制 TACE 的表达.干扰 TACE 基因的表达可有效抑制 HeLa 细胞的增殖并诱导其凋亡.
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楤木皂苷通过降低 Akt／NF-κB 通路抑制HeLa 细胞的增殖并促进其凋亡
目的：探讨！木皂苷对人宫颈癌 HeLa 细胞增殖和凋亡的影响。方法以体外培养的人宫颈癌 HeLa 细胞为研究对象，实验分为阴性对照组和！木皂苷组（50、100、200μg／mL）共4组，分别给予 RPMI-1640培养液和！木皂苷（50、100、200μg／mL）处理。24、48和72 h 后，分别收集各组细胞，采用 MTT 法检测细胞的增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot 技术测定细胞内蛋白（pAkt1、pIкBα、NF-κB p65、Bcl-2和 Caspase-3）表达水平。结果！木皂苷呈时间-剂量依赖性地抑制 HeLa 细胞的增殖，并增加其凋亡水平。另外，！木皂苷显著降低 Akt1和 IкBα的磷酸化水平，减少 NF-κB（亚基 p65）和 Bcl-2的蛋白表达，相反却显著增加 Caspase-3的含量。结论！木皂苷通过降低 Akt／NF-κB 信号通路的活性抑制宫颈癌 HeLa 细胞的增殖并促进其凋亡。
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miR-424慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖的影响
目的：构建hsa‐miR‐424基因慢病毒表达载体，并鉴定miR‐424在细胞内表达水平，研究hsa‐miR‐424对宫颈癌 He‐la 细胞增殖的影响。方法以人基因组 DNA 为模板，设计合成 miR‐424的上下游引物，PCR 扩增目的片段，回收产物将其连入pMD18T 载体中，进行测序。再以 pMD18T‐miR424为模板进行 PCR 扩增，将其中表达 pMD18T‐miR424的结构经酶切后插入pLentis‐CMV‐GFP‐MCS‐PGK‐PURO 载体，构建成 pLentis‐CMV‐GFP‐miR424‐PGK‐PURO ，在293T 细胞中与 pSPAX2、pMD2．G包装产生所需的慢病毒，再用含慢病毒的上清液感染 Hela 细胞。结果 miR‐424基因与慢病毒载体连接成功，测序结果证明了插入到质粒载体中的 miR‐424前体序列完全正确，成功构建 pLentis‐CMV‐GFP‐miR424重组慢病毒载体，用其感染宫颈癌Hela 细胞后上调 miR‐424的表达近60倍。采用 M TT 法检测增殖结果提示：感染 miR‐424慢病毒的宫颈癌 Hela 细胞株均存在细胞增殖减慢。结论成功的构建了 miR‐424慢病毒载体，建立了高效稳定表达 miR‐424的细胞株，并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌 Hela 细胞，成功抑制了 Hela 细胞的增殖，为后续相关的研究奠定了良好的基础。
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siRNA 沉默 YAP1对宫颈癌 Hela 细胞增殖和侵袭的影响
目的：用小干扰 RNA（siRNA）沉默宫颈癌 Hela 细胞中 YAP1基因的表达，观察 YAP1表达降低对细胞增殖和侵袭能力的影响，初步探讨 YAP1在宫颈癌中的作用。方法：qRT - PCR 和 Western blot 方法检测宫颈癌 Hela 细胞及正常宫颈上皮细胞 H8中 YAP1的表达，siRNA YAP1转染 Hela 细胞沉默 YAP1表达，并以转染 control siRNA 的细胞作为对照，转染48h 后，分别用 qRT - PCR 和 Western blot 方法检测沉默效果。用 MTT法检测沉默后细胞增殖情况。Transwell 检测细胞侵袭能力。结果：YAP1在宫颈癌细胞中高表达。siRNA 能够有效沉默 Hela 细胞中 YAP1的 mRNA 及蛋白的表达。沉默 YAP1表达能够明显抑制 Hela 细胞的增殖及侵袭能力。结论：YAP1蛋白在宫颈癌细胞中高表达并具有促进细胞增殖及侵袭的能力。
关键词： Yes 相关蛋白 1 HeLa 细胞 增殖 侵袭 宫颈癌
