香烟烟雾冷凝物急性染毒对16HBE细胞Rap2B基因表达的影响

目的 观察CSC急性染毒对人支气管上皮细胞的毒性特征及Rap2B基因表达的影响,推测Rap2B基因在急性染毒阶段的作用,为后续研究提供实验依据.方法 16HBE细胞暴露香烟烟雾冷凝物(CSC) 24 h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化,CCK-8法确定染毒剂量,荧光定量PCR检测该基因mRNA表达水平,Western Blot检测其蛋白表达水平.结果 CSC对16HBE细胞有毒性作用,半数抑制浓度(IC50)为(0.08±0.006) mg/ml；CSC染毒16HBE细胞24 h后,细胞形态发生一定改变,高剂量组细胞出现明显形态学改变；与对照组比较,1/8 IC50剂量组mRNA和蛋白表达水平上调较高(P＜0.05),随剂量组浓度增高mRNA和蛋白表达下调至低(IC50组,P＜0.05).结论 Rap2B基因的表达在一定范围随着染毒浓度的改变呈现先升高后下降的趋势,提示Rap2B基因可能作为CSC靶基因在其急性染毒过程中发挥一定的作用.

应用定量竞争RT-PCR筛选芳香烃受体基因RNA干扰片段

目的筛选对人气管上皮细胞株16HBE芳香烃受体基因mRNA表达有效抑制的特异RNAi片段.方法自行制备内参照为竞争模板,应用定量竞争RT-PCR方法,分别检测转染有4个不同芳香烃受体基因RNA干扰位点的16HBE细胞芳香烃受体mRNA的表达,评价不同片段的RNA干扰效果.结果转染4种芳香烃受体基因RNA干扰片段的16HBE细胞的每40ng总RNA芳香烃受体基因mRNA平均表达量分别为5.65fg、14.78fg、3.14fg和0.68fg,mRNA表达平均抑制率分别为61.6%、-0.5%、78.6%和95.4%.结论应用定量竞争RT-PCR准确地定量基因的mRNA表达水平,筛查出芳香烃受体基因RNA干扰有效序列,为进一步研究芳香烃受体基因的功能创造了条件.

ObjectiveTo establish the model of human bronchial epithelial cells(16HBE) malignant transformation induced by glycidyl methacrylate(GMA)and define the different methylation genes at different stages. MethodsDNA was extracted at different 16HBE malignant phasesandchanges of genes DNA methylation atdifferent stages weredetectedusing Methylation chip of‘NimbleGen HG18 CpG Promoter Microarray Methylation’. Methylation-specific PCR (MSP) was usedto observe the methylation status ofsome genes, and then compared with the control groups. ResultsThe resultshowed that GMA induced 16HBE morphorlogical transformation at the dose of 8μg/mL, and cell exposed to GMA had 1374 genes in protophase, 825 genes inmetaphase, 1149 genes in anaphase, respectively; 30 genes are all methylation in the 3 stages; 318 genes in protophase but not inmetaphase and anaphase; 272 genes in metaphase but not inprotophase and anaphase; 683 genes in anaphase but not inmetaphase and protophase; 73 genes inprotophase andmetaphase but not in anaphase; 67 genes in protophase and anaphase but not inmetaphase; 59 genes inmetaphase and anaphase but not in protophase. ConclusionThe pattern of DNA methylation could change in the process of 16HBEinduced by GMA.

IL－31对人支气管上皮16 HBE细胞VEGF、EGF及EGFR表达的影响及作用机制

目的：探讨IL－31对16HBE细胞VEGF、EGF和EGFR表达的影响及作用机制。方法 IL－31单独及分别联合P38 MAPK信号阻断剂SB203580或JNK信号阻断剂SP600125处理16HBE细胞，分别用real－time PCR和Western blot检测VEGF、EGF和EGFR mRNA及蛋白表达水平；采取Western blot分别检测P38 MAPK和JNK的磷酸化表达水平。结果与对照组相比，IL－31显著上调VEGF、EGF和EGFR mRNA和蛋白的表达（ P＜0．01），并且能显著上调P38 MAPK和JNK的磷酸化表达（P＜0．01）。与IL－31组相比，IL－31＋SB203580或SB203580组p－P38 MAPK的表达水平均明显下降（P＜0．01），而IL－31＋SP600125或SP600125组p－JNK的表达水平均明显下降（P＜0．01）。与IL－31组相比，IL－31联合SB203580或SP600125组VEGF的表达均明显下降（ P＜0．01），而EGF和EGFR的表达在IL－31联合SB203580组显著下降（P＜0．01）。结论 IL－31可通过激活P38 MAPK及JNK信号通路而诱导VEGF表达；而IL－31诱导的EGF和EGFR表达则主要通过P38 MAPK信号通路介导。

pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体的构建和hTim-3质粒稳定转染16HBE细胞株的建立

目的 筛选表达Tim-3的人呼吸道相关细胞株,为进一步阐明Tim-3可能与人呼吸道疾病相关奠定基础;构建pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体,以期用于hTim-3的功能研究.将测序正确的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3转染入人支气管上皮细胞株16HBE中,筛选出阳性细胞克隆,为后续实验提供理论基础. 方法 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃5％CO2饱和湿度培养箱中体外培养人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82,调整细胞到佳状态,对数生长期时收集细胞,抽提总RNA,逆转录为cDNA.参照人GenBank中Tim-3基因的全长序列,使用Primer5.0设计并合成其引物,采用PCR检测以上3种细胞Tim-3的mRNA.将健康人外周血Tim-3基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pEGFP-C2,经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,构建包含目的基因Tim-3的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3.利用脂质体介导pEGFP-C2-hTim-3质粒和pEGFP-C2质粒分别转染16HBE细胞,荧光显微镜下观察16HBE细胞的瞬时转染效率,并采用含G418的培养基筛选以获得整合pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2的阳性细胞克隆,用荧光显微镜观察pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2在16HBE细胞上的定位表达. 结果 1)PCR显示人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA;2)构建了具有筛选特征和能够稳定表达的pEGFP-C2-hTim-3质粒载体,测序结果与预期设计完全一致;3)瞬时转染后经荧光显微镜检查可见表达pEGFP-C2-hTim-3绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足8％,表达pEGFP-C2绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足15％o.采用G418筛选后获得表达野生型hTim-3和外源性pEGFP-C2-hTim-3的16HBE细胞及转染pEGFP-C2空质粒的16HBE细胞,经荧光显微镜观察前者定位在胞膜上,后者定位于胞质中. 结论 人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA,Tim-3可能与人类呼吸道疾病的发生和发展相关.成功构建了真核表达载体pEGFP-C2-hTim-3并获得了高表达pEG-FP-C2-hTim-3的16HBE阳性克隆细胞,可供后续研究使用.

大气PM2.5对人支气管上皮细胞内钙稳态的影响

目的 研究大气PM2.5对人支气管上皮细胞(16HBE)内钙稳态的影响.方法 以50、100 μg/ml大气PM2.5对16HBE细胞进行染毒,以生理盐水为对照组,并用终浓度为100 μg/ml的钙离子拮抗剂肝素钠进行干预,即设生理盐水对照组、50 μg/ml PM2.5组、100 μg/ml PM2.5组、肝素钠组、50 μg/ml PM2.5+肝素钠组、100 μg/ml PM2.5+肝素钠组,分别染毒3、6、24 h后,以流式细胞仪检测细胞内游离钙离子荧光强度.结果 100μg/mlPM2.5染毒16HBE 3 h后,细胞内钙离子荧光强度高于对照组和50μg/mlPM2.5组;当加入胞内游离钙离子拮抗剂肝素钠后,100 μg/ml PM2.5+肝素钠组钙离子荧光强度低于100 μg/ml PM2.5组.100 μg/ml PM2.5染毒16HBE 6 h后,细胞内钙离子荧光强度高于对照组.PM2.5染毒16HBE 24 h后,50 μg/ml PM2.5组、100.μg/ml PM2.5组、50 μg/ml PM2.5+肝素钠组、100 μg/ml PM2.5+肝素钠组的细胞内钙离子荧光强度均高于对照组,且100 μg/ml PM2.5组细胞内钙离子荧光强度高于50 μg/ml PM2.5组.50、100 μg/mlPM2.5染毒组随着染毒时间的延长,钙离子荧光强度升高,染毒6、24 h后的钙离子荧光强度均高于染毒3h后,上述差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 大气PM2.5可能刺激16HBE细胞释放胞内钙库,导致胞内游离钙离子荧光强度增加.

TLR4在参苏饮及其拆方含药血清诱导炎症16HBE hBD-2mRNA表达中的作用机制研究

目的:使用益气解表代表方参苏饮(《太平惠民和剂局方》)及其拆方的含药血清对炎症16HBE进行干预,从中探讨TLR4在hBD-2mRNA表达中的作用.方法:传代培养16HBE细胞后将其分为5组,用LPS建立细胞炎症模型,加入TLR4抑制剂Anti-Human CD284后分别将培养液替换为含有提前制备的参苏饮及其拆方含药血清培养液,在给药后不同时间点(1/2h,1h,3h,5h,8h)分别取出相应组别细胞培养板,提取细胞总RNA,使用real time PCR检测16HBE炎症模型中以上时间点NF-κBp65 mRNA、hBD-2 mRNA表达量.结果:与空白组比较,模型组NF-κBp65 mRNA相对表达量在1h、5h显著升高(P＜0.05),而hBD-2 mRNA相对表达量仅在1h显著升高(P＜0.05).与模型组比较,参苏饮全方组NF-κBp65 mR-NA、hBD-2 mRNA相对表达量仅在5h显著升高(P＜0.05);益气解表组NF-κBp65 mRNA、hBD-2 mRNA相对表达量仅在3h显著升高(P＜0.05).结论:Anti-HumanCD284阻断TLR4后,参苏饮诱导炎症16HBE表达NF-κBp65 mRNA、hBD-2mRNA明显受抑,表明参苏饮上调NF-κBp65 mRNA、hBD-2 mRNA需要TLR4参与.

氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的研究氯化镉诱发SV40 LargeT抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用.方法体外用不同浓度氯化镉多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度.结果细胞培养至35代,发现氯化镉可诱导16HBE恶性转化.转化细胞排列紊乱、重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01),并呈时间-剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌.结论氯化镉有较强的诱导16HBE恶性转化能力;该转化模型为镉致癌机制的分子水平提供了理想的研究系统.

东风桔不同萃取部位对CSE诱导的16HBE细胞存活率的影响及其抗炎机制

目的 研究东风桔不同极性萃取部位对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人支气管上皮细胞(16HBE)存活率的影响以及炎症相关因子的表达,探讨其作用机制.方法 通过CSE刺激16HBE细胞,使其产生炎性反应,并通过MTT法检测细胞活力、TNF-α等炎症因子的变化,研究东风桔不同极性萃取部位对CSE刺激的16HBE细胞产生的作用.结果 三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部位对CSE刺激的16HBE细胞产生了保护作用,细胞存活率较模型组有显著增高,同时抑制了炎症因子的释放,其中乙酸乙酯部位高剂量组、正丁醇部位高、中剂量组效果与模型组比较差异有统计学意义.结论 乙酸乙酯部位和正丁醇部位可提高CSE刺激的16HBE细胞的存活率,可通过抑制炎症因子的激发达到抗炎作用.

LPS对16HBE细胞AQP1、AQP5表达的影响及作用机制

目的 探讨LPS对16HBE细胞AQP1、AQP5表达的影响及作用机制.方法 用1、10、100、500、1 000 ng/ml的LPS干预16HBE细胞24 h,real-time PCR检测AQP1、AQP5 mRNA的表达;用100 ng/ml的LPS分别干预16HBE细胞0、3、6、12、24、48 h,real-time PCR检测AQP1、AQP5 mRNA的表达;以100 ng/ml的LPS分别干预16HBE细胞0、5、15、30、60 min,Western blot检测p38 MAPK信号通路的变化;LPS单独或联合p38 MAPK特异性阻断剂SB203580干预16HBE细胞24 h,real-time PCR和Western blot分别检测AQP1、AQP5的变化及p38 MAPK信号通路的变化.结果 与对照组相比,10、100、500、1 000 ng/ml的LPS均可显著抑制AQP1和AQP5的表达(P＜0.01),且具有剂量依赖效应;100 ng/ml的LPS干预16HBE细胞3h后,AQP1和AQP5 mRNA的表达即发生下降,并于24 h降到低;LPS能够显著激活p38 MAPK信号通路,其磷酸化水平于30 min达到高峰;与LPS单独干预组相比,LPS+ SB203580组AQP1和AQP5的表达水平发生明显上升(P＜0.01).结论 LPS可通过激活p38 MAPK信号通路下调16HBE细胞AQP1和AQP5的表达.

肿瘤坏死因子-α可诱导GSTM5核转位

目的 构建稳定表达谷胱甘肽S转移酶mu5 (GSTMS)的人支气管上皮16HBE细胞株,探讨诱导GSTM5核转位的关键因素.方法 构建表达GSTM5基因的重组慢病毒载体(PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C)并制备出相应的慢病毒,感染人支气管上皮16HBE细胞后,经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法(Western blot)分别检测细胞株中GSTM5的mRNA、蛋白表达水平;以肿瘤坏死因子-α (TNF-α;10 ng/ml)刺激稳定转染细胞株(稳转株)0.5 h,共聚焦荧光显微镜检测GSTM5核转位.结果 成功构建稳定表达GSTM5人支气管上皮细胞株(16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N、16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C);荧光共聚焦显微镜显示稳转株在TNF-αt刺激诱导后,GSTM5由胞浆转入胞核,以16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N稳转株更显著.结论 TNF-αt刺激可诱导GSTM5人支气管上皮细胞株中GSTM5发生核转位,可能与其N端含有非经典核定位信号密切相关.

RNA干扰诱导DNA修复基因hMGMT表达沉寂的研究

背景与目的:构建能特异诱导人DNA修复基因hMGMT表达沉寂的RNA干扰载体.材料与方法:通过两步法聚合酶链反应(Polymerasing chain reaction,PCR)扩增hMGMT特异RNA干扰表达盒,连入质粒载体构建RNA干扰质粒pU6-MGMTi,与pGEFP-C1共转染人支气管上皮16HBE(Human bronchial epithelial)细胞,G418筛选后,采用RT-PCR和Western Blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达抑制情况.结果:成功构建hMGMT特异RNA干扰质粒pU6-MGMTi,转染16HBE细胞的mRNA和蛋白表达受到显著的抑制.结论:应用RNA干扰表达盒以及共转染技术,构建MGMT基因表达沉寂的细胞株,为进一步阐明MGMT基因的功能创造条件.