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可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立鉴定和表型分析
目的 建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用,研究SpeedyA基因下调对精子发生的影响. 方法 体外实验筛选下调SpeedyA基因表达的有效干扰片段,Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒(pRP.EX2d-TRE＞ shSpdya),受精卵显微注射该质粒建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠为四环素诱导的SpeedyA-RNA干扰转基因小鼠模型,喂食强力霉素(Dox)诱导RNA干扰片段的表达下调SpeedyA基因的表达;实时荧光定量PCR法检测模型组小鼠与喂食强力霉素的正常小鼠(对照组)SpeedyA的表达差异;HE染色观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况. 结果 模型组小鼠Speedy A基因的表达量与对照组小鼠的表达量相比下降26％;模型组小鼠睾丸组织发生异常的生精细胞凋亡. 结论 成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性SpeedyA-RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统在体研究精子发生相关基因的功能;SpeedyA基因表达下调可使生精细胞发生异常凋亡.
关键词： TET-ON系统 Speedy A基因 RNA干扰 精子发生 -
人巨细胞病毒即刻早期蛋白IE2在Tet-On系统调控下的表达及其抗凋亡作用
即刻早期蛋白IE2是人巨细胞病毒(HCMV)感染后先表达的蛋白质,具有调节细胞周期和抑制细胞凋亡的作用.但IE2蛋白的表达水平与其抗凋亡活性之间的关系尚不清楚.本实验通过建立Tet-On系统调控下表达HCMV IE2蛋白的细胞株,在不同诱导条件下检测IE2蛋白对细胞凋亡和p53表达的影响.结果发现IE2蛋白能抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,其抑制效应与IE2蛋白的表达量相关,而原位杂交结果显示IE2蛋白不影响p53的表达,提示IE2蛋白可能通过多种途径抑制细胞凋亡.
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慢病毒Tet-On系统调控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12细胞中表达的研究
目的:构建Tet-On系统调控的人源性Notch1胞内段(NICD)和EGFP融合蛋白的慢病毒真核表达载体,并探讨Notch1-EGFP在PC12细胞中的表达条件.方法:采用RT-PCR从人胎盘组织中获得NICD的cDNA,利用PCR扩增pEGFP-Cl质粒中EGFP的编码序列,两者均定向克隆到pcDNA3.1(+)质粒中组成Notch1-EGFP片段,将该片段进一步酶切回收,并定向克隆到pLVX-Tight-puro载体获得pLVX-Notch1-EGFP.将构建好的质粒进行病毒包装并感染PC12细胞,抗性筛选2周.在不同时间点和不同浓度Dox作用下,用荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测Notch1表达.结果:酶切和DNA测序均证实pLVX-Notch1-EGFP质粒构建成功.镜下可见感染后的PC12细胞在500 ng/ml Dox诱导36 h时90％以上细胞均表达EGFP.流式细胞术检测Notch1表达结果显示,随着Dox浓度增加,Notch1阳性细胞百分比逐渐增加；随着Dox诱导时间延长,Notch1阳性细胞百分比逐渐增高,到36h时达到高(81.5％).结论:成功构建携带Notch1-EGFP融合蛋白的Tet-On调控的慢病毒真核表达载体,实现在PC12细胞中调控Notch1-EGFP融合蛋白的表达.
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Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体的构建和鉴定
目的 构建和鉴定Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体.方法 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连于pTRE-shuttle2质粒的EcoRⅠ酶切位点,经EcoRⅠ酶切鉴定.亚克隆重组质粒片段于腺病毒载体Adeno-XTM,构建重组Adeno-X-hTERT,以PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切、聚合酶链反应(PCR)以及进一步测序鉴定其方向.结果 重组质粒经EcoR Ⅰ酶切后得到预期的3.5、0.88、3.55 kb大小的3条片段,重组腺病毒载体经PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切,出现预期32.6、5.09 kb片段,与理论计算值完全一致,PCR及测序结果进一步确认了结构与方向的正确性.结论 成功构建了Tet-on系统调控人端粒酶催化亚单位基因hTERT的重组腺病毒表达载体.
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携带人骨形态发生蛋白2可诱导慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的成骨
背景:tet-on慢病毒载体除了具有传统慢病毒载体的优点外,因载入一个反向反式激活因子,可通过强力霉素或其类似物对目的基因的表达进行调控.目的:观察携带骨形态发生蛋白2的tet-on慢病毒载体对人脐带间充质干细胞转染表达及稳定转染后成骨的影响.方法:取第3代人脐带间充质干细胞分组培养:实验组稳定转染携带骨形态发生蛋白2的tet-on慢病毒载体,并加入10 mg/L强力霉素;未加强力霉素组:同实验组但不加强力霉素;空病毒组转染携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体;空白对照组未进行任何处理.结果与结论:①骨形态发生蛋白2表达:实验组、未加强力霉素组均有表达,且实验组表达量高于未加强力霉素组(P < 0.05);空病毒组、空白对照组未见表达.②碱性磷酸酶染色:实验组可见细胞胞浆中出现大量红色或红棕色颗粒,未加强力霉素组可见少量红色颗粒,实验组碱性磷酸酶活性高于未加强力霉素组(P < 0.05);空病毒组、空白对照组未见明显红色颗粒.③茜素红染色:实验组、未加强力霉素组均可见钙结节形成,实验组较未加强力霉素组矿化结节数量多,面积更大;空病毒组、空白对照组未见明显矿化结节形成.表明携带骨形态发生蛋白2的慢病毒载体可稳定转染人脐带间充质干细胞,显著增强其成骨能力.
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多西环素调控的重组杆状病毒载体Ac-EGFP及Ac-HGF的构建
目的 将Tet-On系统与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或肝细胞生长因子(HGF)共同构建于一新型重组杆状病毒载体,并以不同浓度的多西环素(DOX)调控EGFP及HGF表达.方法 酶切重组质粒pFast-Tet、pTRE-EGFP和pTRE-HGF,回收目的片段后连接pFast-Tet,分别转化含有AcMNPV Bacmid和helper质粒的DH10Bac感受态细胞,筛选后提取Bacmid DNA并鉴定(命名为Ac-EGFP和Ac-HGF).将Ac-EGFP和Ac-HGF感染骨髓间充质干细胞,加入不同浓度的DOX调控EGFP(DOX浓度为0、200、500、1 000 ng/mL)和HGF(DOX浓度为0、10、100、500、1 000、1 200 ng/mL)的表达.在荧光显微镜下观察EGFP的表达,用ELISA法检测HGF的表达量.结果 经鉴定EGFP、HGF与Tet-On系统成功构建在同一杆状病毒载体,且在骨髓间充质干细胞中具有较高的感染率.在较高浓度DOX调控下改造后的重组杆状病毒可高表达EGFP和HGF,低浓度或无DOX时表达量逐渐减低.结论 本研究证实可将Tet-On系统与EGFP或HGF共同构建于一新型重组杆状病毒载体,改造后的重组杆状病毒能稳定、高效感染骨髓间充质干细胞,不同浓度的DOX可调控EGFP及HGF的表达,无DOX时呈低本底.
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新型shRNA慢病毒载体抑制TGIF表达及对TGF-β通路的调节
目的 构建针对同源域蛋白TGIF(5′-TG-3′interacting factor)可诱导表达shRNA的慢病毒载体,鉴定其在大肠癌细胞系DLD1中对TGIF的基因沉默效率,进一步研究其对TGF-β信号通路下游基因的影响.方法 设计并合成针对TGIF的RNA干扰序列,克隆到可被强力霉素诱导的新型Tet-on慢病毒载体,将慢病毒颗粒感染大肠癌细胞系DLD1细胞.培养并分离细胞克隆后,使用强力霉素(doxcycline)进行诱导,用Real-Time PCR和Western印迹法检测TGIF和PAI-1的表达情况.结果 构建了针对TGIF可诱导shRNA的真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染大肠癌细胞系DLD1.在强力霉素诱导下,TGIF在DLD1细胞系的表达得到有效抑制,TGF-β下游基因PAI-1和p15表达明显升高.结论本研究成功构建了可诱导表达shRNA慢病毒载体,其在强力霉素诱导下可以有效抑制TGIF在大肠癌细胞系内的表达；TGIF可以抑制TGF-β信号传导通路.
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EphA1基因可控性双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA的建立
目的 建立可调控EphA1基因表达的内皮祖细胞系EPCsTetOn-EphAl1SiRNA.方法 将pWHE146质粒转染到内皮祖细胞系中,筛选出稳定表达的细胞克隆；扩增后瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒,强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶活性,挑选出高表达、低背景的受强力霉素调控的EPCsTet-On细胞株；再将重组质粒pTRE-EphA1SiRNA转染入EPCsTet-On细胞株,筛选出稳定表达细胞克隆EPCsTer-On·EphAlSiRNA;通过强力霉素诱导后,利用RT-PCR和Western blotting法检测EphA1基因mRNA与蛋白的表达.结果 成功构建了受强力霉素调控的高表达低背景的EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株；强力霉素可诱导EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株中EphA1mRNA表达下调,较之未调控组其差异有统计学意义(P＜0.05)；强力霉素调控EphA1蛋白表达的能力在一定范围内呈剂量依赖性关系.结论 成功建立强力霉素调控EphA1基因表达的大鼠双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA,为深入研究EphA1基因在内皮祖细胞参与肝癌血管生成过程中的作用提供了有效的实验手段.
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诱导性表达人巨细胞病毒UL138蛋白的胃癌细胞株构建及其效应评价
目的:构建可诱导表达人巨细胞病毒(HCMV)UL138蛋白的稳定遗传胃癌细胞系,并评价UL138对胃癌细胞的生物学效应.方法:将pCMV-tet3G质粒转染BGC-823胃癌细胞,通过G418及荧光素酶活性检测筛选BGCTet-on细胞株.再将含有UL138外源基因的pTRE3G-UL138质粒转染稳定BGCTet-on细胞株,通过G418及潮霉素双抗筛选,获得诱导性表达UL138基因的胃癌细胞(BGC-UL138Tet-on).强力霉素(DOX)诱导后,采用Western blot验证UL138蛋白表达,采用流式细胞术及CCK8试剂盒检测UL138蛋白表达对胃癌细胞的生长周期及增殖的影响.构建荷瘤裸鼠模型,体内验证UL138蛋白表达对胃癌细胞增殖的影响.结果:成功构建了DOX诱导性表达的、携带UL138基因的BGC-UL138Tet-on稳转细胞株.UL138蛋白表达可显著抑制胃癌细胞增殖;流式细胞术检测显示UL138蛋白表达阻滞BGC-823细胞周期在G1期.荷瘤裸鼠模型体内实验发现,DOX腹腔注射诱导UL138蛋白表达后,BGC-UL138Tet-on移植瘤体积缩小甚至消失.结论:成功构建可诱导表达UL138蛋白的胃癌细胞株,进一步证实HCMV基因UL138的表达可在体内和体外抑制胃癌细胞的增殖,细胞实验提示细胞周期阻断在G1期.
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Tet-on系统对胰岛细胞瘤中TRB3基因的表达调控作用
目的 构建Tet-on系统可控表达TRB3基因的胰岛细胞瘤细胞株.方法通过Tet-on系统将TRB3质粒转染INS-rβ(r9)细胞中,经潮霉索筛选,克隆扩增得到可诱导表达TRB3基因的细胞系.采用实时定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western Blot检测该基因表达的可诱导性.结果 三种检测方法都显示,500 ng/ml DOX诱导48 h可使转染的r9细胞中TRB3基因表达达到峰值,mRNA表达可上调60倍.结论 通过本研究结果 得到可控的TRB3高表达细胞株,为进一步研究该基因在胰腺肿瘤细胞中的功能提供了良好的细胞模型.
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慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究
目的：观察改良Tet-On系统修饰慢病毒( Lv-TH-GD-NF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法①用 Lv-TH-GDNF 与 rtTA2s-M2病毒感染 HeLa 细胞,免疫印迹法检测强力霉素( Dox )对TH、GDNF基因表达的调控。②用 Lv-TH-GDNF 与 rtTA2s-M2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡( APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体 DA、DOPAC 含量评估 Lv-TH-GDNF治疗效应；通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果①在体外HeLa细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。②在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善( P<0．01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高( P<0．01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-TH-GDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。
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Tet-on系统调控A20基因在鼻咽癌肝转移亚系中的表达
目的 构建pSUPERIOR-A20可调控性载体,检测其在肝转移亚系中表达的可调控性.方法 通过基因芯片筛选出鼻咽癌肝转移相关基因,结合文献调研获得头颈部癌转移标签基因,并通过荧光定量PCR检测发现A20可能在鼻咽癌肝转移过程中发挥了重要作用.在线设计A20特异性干扰片段,选择相应酶切位点后将其插入pSUPERIOR质粒中,应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将pSUPERIOR质粒和Tet-on质粒共转染肝转移亚系5-8F-H3,PCR检测A20的表达.结果 Real-time PCR检测A20在肝转移亚系5-8F-H3中的表达显著上调,结果具有统计学意义(P=0.005).且成功构建了pSUPERIOR-A20载体,与Tet-on质粒共转染5-8F-H3后经嘌呤霉素筛选克隆,经荧光定量PCR检测阳性克隆A20基因的表达显著下调.结论 成功构建pSUPERIOR-A20载体,并可有效干扰鼻咽癌肝转移亚系5-8F-H3中A20基因的表达,为进一步研究A20在鼻咽癌肝转移中的作用奠定了良好的基础.
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利用Tet-on系统构建调控APPswe基因表达的SH-SY5Y细胞模型
目的 利用Tet-On诱导可调控系统构建表达淀粉样前体蛋白突变基因(APPswe)细胞模型.方法 构建重组质粒pTRE-APPswe-Flag,利用慢病毒将其包装转染SH-SY5Y细胞.Puromycin筛选72 h后,通过强力霉素诱导,Western blot检测验证,免疫荧光检测APPswe表达情况.结果 强力霉素诱导后,筛选的细胞Western blot检测Flag标签蛋白表达明显,免疫荧光显示APPswe蛋白表达增加;撤掉强力霉素后,APPswe蛋白表达减少.结论 成功构建了可调控Tet-On-APPswe表达SH-SY5Y细胞系统模型.
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建立doxycycline诱导表达Xaf1的肿瘤细胞株
[目的]为探索XIAP相关因子1(Xaf1)调节肿瘤细胞凋亡的机制,利用基因开关调节系统(Teton),拟建立由doxycycline调控表达的Xaf1诱导细胞株.[方法]将pTREHA-Xaf1和pWZL-Hyg质粒用基因转染技术转入稳定表达rtTA的Saos-2细胞中.经过hygromycin的抗性筛选,挑出并扩增表达Xaf1的细胞株.在8例实验组中加入doxycycline,和不加doxycycline的8例对照组比较,重复3次实验用免疫印迹法和免疫荧光显微镜检测doxycycline对Xaf1表达的调控.Xaf1诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示.[结果]在30个抗hygromycin的细胞株中,免疫印迹法筛选出5个明显由doxycycline调控诱导表达Xaf1的细胞株,免疫荧光显微镜检测显示doxycycline诱导Xaf1表达于细胞核内.流式细胞检测Xaf1于8h开始诱导Saos细胞凋亡,凋亡率高约20%,而且不影响细胞周期.[结论]Xaf1-Saos诱导细胞株是研究Xaf1调节肿瘤细胞凋亡机制的良好细胞模型;Xaf1是一种核蛋白,能独立诱导肿瘤细胞凋亡.
关键词： TET-ON系统 XIAP相关因子1(Xaf1) 凋亡 肿瘤 诱导细胞株 -
利用Tet-on诱导基因表达系统构建EID3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立
目的 构建类E1A细胞分化抑制因子3(EID3)真核表达载体,并转染人乳腺癌细胞(MCF-7),建立Tet-on诱导表达的目的基因EID3的稳定转染细胞系.方法 应用PCR技术,得到目的基因EID3的cDNA,通过双酶切、胶回收方法纯化目的片段EID3.DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pLVu-Tight-Puro,经菌落酶切、电泳以及测序鉴定.将真核表达质粒pLVu-Tight-Puro-EID3和pLVX-Tet-On Advanced Vector转染MCF-7细胞,分别通过G418和嘌呤霉素选择培养,建立由四环素(doxycycline,DOX)诱导表达的稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测目的基因EID3在DOX诱导下mRNA以及蛋白的表达.结果 成功构建了pLVu-Tight-Puro-EID3表达质粒,并建立了由DOX诱导表达的稳定转染细胞系,可在DOX诱导下稳定表达EID3基因的mRNA及蛋白.结论 人EID3稳定表达细胞系为研究EID3基因在肿瘤辐射敏感性及药物敏感性的作用提供实验基础.
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pri-mir-302/367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定
目的:构建可诱导表达pri-mir-302/367的慢病毒载体,并研究miR-302/367家族基因miR-302a/b/c/d和miR-367及其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在HeLa细胞中的诱导性表达.方法:以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增pri-mir-302/367基因.经双酶切后连接入pLV-TRE质粒,构建pLV-TRE-302慢病毒重组体,酶切及测序予以鉴定.将重组质粒和辅助质粒共同转染293 FT细胞,并测定病毒滴度.用病毒转染HeLa细胞,强力霉素(doxycline,DOX)诱导后,通过real-time PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因的表达.实验分为诱导组(DOX+)、非诱导组(DOX-)和空白组(blank).结果:酶切及测序证实重组慢病毒载体pri-mir-302/367构建成功,病毒滴度为5×106 TU/ml;DOX诱导72 h后,real-time PCR结果显示诱导组高于非诱导组和空白组(P＜0.05,其中miR-302a:PDOX+vsmX-=0.032,PDOX+vs.blank=0.048;miR-302b:POX+vs.POX-=0.001,PDOX+vs.blank=0.001;miR-302c:PDOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=0.000;miR-302d:PDOX+vs.DOX-=0.002,PDOX+vs.blank=0.047;miR-367:PDOX+vs.DOX-=0.001,PDOX+vs.blank=0.001;OCT4:PDOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=O.001;SOX2:PDOX+vs.DOX-=0.000,PoX+vvs.blank=0.000;NANOG:PDOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=0.000),而非诱导组与空白组相比差异无统计学意义(P＞0.05,其中miR-302a:Pblankvs.DOX_=0.057;miR-302b:Pblankvs.DOX_=0.832;miR-302c:Pblank vs.DOX-=0.445;miR-302d:Pblank vs.DOX_=0.979;miR-367:Pblank vs.DOX-=0.161;OCT4:Plank vs.DOX-=0.051;SOX2:Plank vs.DOX-=0.060;NANOG:Pblank vs.DOX-=0.078).结论:成功构建了携带人miR-302/367可控性慢病毒载体,为后续的重编程研究奠定了实验基础.
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Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体的构建和鉴定
目的 构建和鉴定Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体.方法 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连于pTRE-shuttle2质粒的EcoRⅠ酶切位点,经EcoRⅠ酶切鉴定.亚克隆重组质粒片段于腺病毒载体Adeno-XTM,构建重组Adeno-X-hTERT,以PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切、聚合酶链反应(PCR)以及进一步测序鉴定其方向.结果 重组质粒经EcoR Ⅰ酶切后得到预期的3.5、0.88、3.55 kb大小的3条片段,重组腺病毒载体经PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切,出现预期32.6、5.09 kb片段,与理论计算值完全一致,PCR及测序结果进一步确认了结构与方向的正确性.结论 成功构建了Tet-on系统调控人端粒酶催化亚单位基因hTERT的重组腺病毒表达载体.
