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shRNAs介导的Smad2基因在小鼠成纤维细胞NIH/3T3中表达的沉默
目的 通过构建5个shRNA表达质粒,对转化生长因子β/Smads信号通路中受体调节性Smads蛋白中的Smad2的表达进行抑制.方法 针对鼠Smad2基因的mRNA序列,设计合成了5条shRNA-Smad2 DNA序列,分别插入至shRNA表达载体中,获得了5个shRNA-Smad2表达质粒,将shRNA表达质粒转染NIH/3T3细胞,采用半定量RT-PCR和Western blotting方法,检测shRNA表达质粒对Smad2表达的抑制效果.结果 编号为2.4的shRNA-Smad2表达质粒能够显著降低Smad2的表达,同时发现由不同的shRNA-Smad2表达质粒组成的RNAi池,产生的抑制效果比单个RNAi表达质粒的抑制效果明显提高.结论 成功地构建了特异、高效抑制Smad2表达的shRNA表达质粒.
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染色体数目异常自然流产胚胎有丝分裂关卡蛋白基因的研究
目的 讨染色体数目异常自然流产胚胎中有丝分裂关卡蛋白(hsMAD2)基因的功能.方法 分别用定量PCR和Westarn blotting在mRNA和蛋白水平检测染色体数目异常(实验组)和正常(对照组)的自然流产胚胎组织中目的 基因的表达;构建针对hsMAD2基因的shRNA表达载体,抑制胚胎细胞内源性hsMAD2基因的表达.用Western blotting和定量PCR方法评价shRNA的干扰效果;用MTT法测定细胞增殖率;流式细胞术检测细胞周期.结果 hsMAD2蛋白在实验组中的表达显著低于对照组.shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hsMAD2基因的表达.胚胎细胞转染有效干扰质粒48 h后,细胞增殖抑制率达58%.有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多. 结论 hsMAD2基因表达下调可能在染色体数目异常的自然流产胚胎发生中起着很重要的作用,为寻找可靠的临床检测指标奠定了基础.
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鞘内注射突触后致密蛋白95siRNA对神经病理性疼痛大鼠脊髓CaMKⅡα活性的影响
目的 探讨突触后致密蛋白95(PSD-95)基因沉默对神经病理性疼痛模型大鼠脊髓Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)表达及活性的影响.方法 用化学合成针对大鼠PSD-95基因的siRNA转染神经母细胞瘤/大鼠神经胶质细胞瘤杂交瘤细胞(NG108-15细胞),并观察干扰效果.选取91只成年SD大鼠随机分为3组:Naive组、假手术组(sham)与坐骨神经慢性缩窄损伤(CCI)手术组.CCI组大鼠进一步被分为4个亚组,分别于CCI术后第5天开始鞘内注射生理盐水(Control组)、转染试剂(Vehicle组)、阴性对照(mmRNA组)和PSD-95基因特异siRNA(siRNA组).连续给药3d,各组大鼠分别于鞘内给药后第1、3、7天评估机械缩足反射阈值(MWT)的改变,并留取腰4～6脊髓节段标本,以Western blotting方法观察脊髓背角PSD-95、CaMKⅡα蛋白表达水平及活性的变化.结果 大鼠PSD-95基因特异的siRNA可以有效地沉默NG108-15细胞中PSD-95基因表达.与生理盐水治疗组相比,鞘内注射PSD-95特异siRNA 3d后,大鼠脊髓背角PSD-95蛋白水平明显降低(P＜0.05),CCI大鼠神经病理性疼痛得到明显缓解(P＜0.05),同时脊髓背角pThr286 CaMKⅡα蛋白水平受到明显抑制(P＜0.05),而总CaMKⅡα蛋白水平无明显变化(P＞0.05).结论 PSD-95基因特异的siRNA可被成功导入大鼠中枢神经系统,引起脊髓PSD-95基因沉默,在缓解病理性疼痛的同时可抑制神经损伤导致的脊髓CaMKⅡα磷酸化水平的增加,阻断中枢敏化相关的信号通路.
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RNA干扰介导的端锚聚合酶1表达下调诱导人神经母细胞瘤细胞的凋亡
目的 探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对入神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础.方法 根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,利用慢病毒作为载体,构建目的基因的RNAi序列.慢病毒感染SH-SY5Y细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测TNKS1基因的表达,筛选出佳干扰序列进行后续实验.然后进行克隆形成实验,检测RNAi-TNKS1后细胞增殖能力的改变.并进一步用Western blotting法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,后用透射电镜观察凋亡形态的改变,探讨RNAi-TNKS1对细胞凋亡的影响及其作用机制.结果 慢病毒载体构建成功,病毒滴度为5×1011TU/L.Real-time PCR检测结果显示,#3shRNA为佳的有效靶点.克隆形成实验的结果显示,RNAi-TNKS1后SH-SY5Y细胞的克隆形成率较对照组明显下降.Western blotting结果显示,RNAi-TNKS1可显著抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-3蛋白的表达.此外,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达也降低.透射电镜结果显示,RNAi-TNKS1后细胞呈现明显的凋亡结构和形态.结论 RNAi介导的TNKS1的表达下调可降低SH-SY5Y细胞的体外增殖能力,诱导其凋亡,可能部分是通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用.
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shRNA抑制SGK1基因表达对人乳腺癌细胞系生物学特性的影响
目的 建立稳定抑制血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(SGK1)表达的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,观察SGK1基因沉默对人乳腺癌细胞生物学特性的影响. 方法 构建针对SGK1的shRNA干扰质粒pGen -3-siSGK1和阴性对照质粒pGen-3-control.转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经G418筛选得到稳定抑制SGK1表达的乳腺癌细胞模型；实时定量PCR、免疫荧光以及Western blotting检测shRNA干扰组、阴性对照组及未转染组细胞中SGK1的表达；四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞体外生长能力；体外浸润实验、细胞迁移实验检测各组癌细胞的侵袭和转移.结果 成功构建针对SGK1基因的shRNA干扰质粒,建立了稳定抑制SGK1表达的乳腺癌细胞模型；与阴性对照组和未转染组相比,肿瘤细胞中SGK1的表达水平显著降低(P＜0.01)；SGK1基因沉默后,人乳腺癌细胞的生长能力、浸润和迁移能力均明显降低(P＜0.05).实验中还发现抑制SGK1基因表达之后,β-catenin的含量也出现明显下降.结论 抑制SGK1基因的表达可以显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长,并降低其侵袭转移的能力,其中β-catenin参与了SGK1基因的抑制功能.
关键词： 乳腺癌 血清和糖皮质激素调节蛋白激酶 β-catenin RNA干扰 免疫印迹法 -
RegⅠ在胃泌素促胃癌细胞体外增殖通路中的作用
目的 探讨再生蛋白I (RegⅠ)在胃泌素刺激胃癌细胞增殖通路中的作用.方法 根据RegⅠ cDNA已知序列,在线设计3个小干扰RNA,并经基因库同源性比较,构建其RegⅠ-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3),利用脂质体2000转染试剂分别转染胃癌细胞BGC823细胞株、SGC7901细胞株,同时设转染空质粒的实验对照组和无质粒转染的空白细胞组.后经G418筛选建立稳定转染细胞株.RT-PCR检测RegⅠ基因mRNA的转录水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测胃泌素孵育对胃癌细胞增殖的效应.结果 酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个RegⅠ-shRNA表达载体构建成功;RT-PCR显示,pSUPER-EGFP-REG/1可有效抑制RegⅠ mRNA在胃癌细胞BGC823、SGC7901的转录.Western boltting结果显示,BGC823和SGC7901细胞的RegⅠ蛋白表达率分别下调到空载体对照组的(45±4)%和(53±4)%;MTT结果显示,RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系的增殖效率均降低(P＜0.05).胃泌素孵育后,胃癌细胞BGC823、SGC7901的增殖效率均增加(P＜0.05),而RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系增殖效率则无明显改变(P＞0.05).结论 实验成功建立了RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系; RegⅠ基因可能对胃泌素促胃癌细胞的增殖有促进的作用.
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TRIM28siRNA通过活化E2F转录因子1增加非小细胞肺癌PAa细胞对依托泊苷的敏感性
目的 探讨siRNA沉默TRIM28(tripartite motif containing 28)增强非小细胞肺癌(NSCLC) PAa细胞对依托泊苷的敏感性和可能的机制.方法 应用RNA干扰技术沉默TRIM28基因在PAa细胞中的表达;TRIM28siRNA单独或联合依托泊苷处理PAa细胞后,应用MTT法和集落形成实验检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blotting方法检测各组细胞中E2F转录因子1(E2F1)的表达水平.结果 在PAa中沉默了TRIM28的表达;TRIM28siRNA联合依托泊苷显著抑制PAa细胞的增殖和集落形成,明显诱导细胞凋亡;联合处理的PAa细胞中E2F1 mRNA和蛋白水平的表达明显增加,同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少.结论 TRIM28siRNA联合化疗药物依托泊苷对抑制NSCLC细胞生长有明显效果.
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Galecin-3在膜联蛋白A7表达抑制的HeLa细胞中的表达变化
目的 探讨膜联蛋白A7(ANXA7)表达抑制的HeLa细胞galectin-3(gal-3)的表达改变.方法 将细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组.采用RNA干扰技术将靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA脂质体2000转染法分别转染宫颈癌细胞系HeLa细胞,空白对照组不予任何处理.转染48h后采用Western blotting法和RT-PCR法分别在蛋白水平和mRNA水平进行抑制效果的鉴定.Western blotting和实时定量PCR法分别检测ANXA7表达抑制的HeLa细胞中galectin-3的表达改变.结果 靶向ANXA7的siRNA可显著抑制ANXA7的表达;当ANXA7表达受抑后,galectin-3在HeLa细胞中的表达显著下降,与阴性对照组和空白对照组相比,差异有显著性(P＜0.05).结论 ANXA7表达抑制的宫颈癌细胞系HeLa细胞中galectin-3的表达显著下调,这可能是ANXA7表达受抑的细胞行为学发生改变的机制之一.
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ZAC基因在奥曲肽抑制胃癌细胞体外增殖通路的作用
目的 探讨ZAC基因在生长抑素类似物奥曲肽(OCT)抑制胃癌细胞增殖通路的作用.方法 分别以不同浓度OCT处理胃癌细胞BGC823和SGC7901不同时间,MTT法筛选其增殖抑制的有效条件.OCT处理胃癌细胞(有效浓度/不同时间,有效时间/不同浓度),Western blotting检测OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应.设计3条ZAC基因RNA干扰片段,分别插入pSUPER-EGFP-Ⅰ载体,构建3个ZAC-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-ZAC/1、pSUPER-EGFP-ZAC/2和pSUPER-EGFP-ZAC/3).经酶切和序列分析鉴定后,分别转染胃癌细胞BGC823和SGC7901.经G418筛选,RT-PCR鉴定,建立ZAC基因敲低(knock-down)的胃癌细胞系.以有效条件OCT孵育胃癌细胞(对照组)和ZAC基因敲低胃癌细胞(实验组),MTT法检测OCT对胃癌细胞的生长抑制效应.结果 OCT抑制胃癌细胞增殖的有效条件为10nmol/L孵育24h;OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达.酶切及序列分析鉴定表明ZAC-shRNA表达载体构建成功.转染shRNA-ZAC/2的胃癌细胞,其ZAC mRNA水平明显降低(P＜0.05),为ZAC基因敲低胃癌细胞.ZAC基因敲低胃癌细胞的增殖明显高于对应的BGC823细胞和SGC7901细胞(P＜0.05).OCT孵育后,BGC823细胞和SGC7901细胞的增殖明显降低(P＜0.05).然而,ZAC基因敲低胃癌细胞的增殖无明显改变(P＞0.05).结论 OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达;ZAC基因在OCT抑制胃癌细胞增殖通路中具有重要作用.
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RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR(Real-time PCR)检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V(Annexin V)染色并用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74％;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加.结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡.
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RNA干扰
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是几近年发现的基因表达调节新机制,双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)以调节子的身份降解目的mRNA,从而调节目的基因的表达.这一发现使人们重新认识了RNA在基因信息流控制过程中的重要性.RNAi的发生机制除了研究多的转录后基因沉默外,还发现与翻译水平调节和基因组甲基化等事件有关.RNAi被应用于生命科学的很多方面:在基因功能研究中它已成为倍受青睐的基因敲下的工具,而且它正促使新一轮基因组范围内基因功能研究运动的蓬勃开展;在癌症、病毒疾病以及代谢失调症等重大疾病的治疗方面,RNAi正显示出巨大的临床应用潜力,犹如给医药界带来了新鲜空气一样令人振奋.
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膜联蛋白A5低表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖与凋亡的影响
目的 观察宫颈癌细胞系HeLa细胞在膜联蛋白A5表达降低后,细胞增殖和凋亡的情况. 方法 采用BNA干扰的方法,通过免疫印迹法筛选出对HeLa细胞中膜联蛋白A5的表达抑制效率高的siRNA,脂质体法将siRNA转染入细胞48h后,用MTT法检测细胞增殖的改变情况,用细胞凋亡光学检测试剂盒检测细胞的凋亡.结果 Helm细胞中膜联蛋白A5的表达被显著抑制,其增殖速度与未转染siRNA的普通HeLa细胞相比,无显著性差异;细胞凋亡显著减少,与未转染siRNA的普通HeLa细胞相比,有显著性差异. 结论 膜联蛋白A5低表达对宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖未见显著影响,但可能影响了细胞的凋亡.
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应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究
为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达.针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达.此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化.根据实时荧光定量P(=R结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达.此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率.实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径.
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蜱 RNA 干扰的不同方法与应用
蜱是一种重要的媒介寄生虫，通过叮咬吸血，寄生于动物体表并在人与动物之间传播病原，引发多种蜱传性疾病。 RNA干扰技术能够特异性沉默目的基因，干扰转录过程。在蜱的研究中应用RNA干扰技术，是开展蜱功能基因组学研究和相关分子机制研究的重要方法，也是创制新型蜱与蜱传病防治技术的重要途径。本文综述了目前蜱研究中运用RNA干扰方法的研究进展，对不同方法优缺点及其应用适用性做出讨论。
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RNA干扰:脑学习和记忆的可能机制
dsRNA介导同源靶基因沉默的RNA干扰(RNAi)是转录后基因水平沉默的主要作用方式,具有普遍的生物学意义.RNAi是dsRNA介导的核酸酶作用于dsRNA(>26nt)同源不成熟mRNA的酶解过程,mRNA降解为21-23nt的dsRNA而使基因表达沉默.RNAi所具有的特性和脑学习和记忆的特征,提示RNAi可能是RNA介导的脑记忆移转的潜在机制.
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RNA干扰作用研究进展
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是指与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA分子(double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞时,该mRNA发生特异性的降解,导致基因表达的沉默.本文介绍RNAi作用的发现、机制和目前使用的产生RNAi的方法.
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应用RNA干扰技术抑制哺乳动物体内基因表达
双链RNA(dsRNA)诱导与之同源的mRNA降解,从而导致转录后基因缄默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的现象或机制被称为RNA干扰(RNA interference, RNAi).对RNAi现象和机制的研究进展非常迅速.特别是近年来,RNAi已被发展成为一个新的强有力的工具,在反向基因组学、基因治疗、抗病毒感染等方面显示出了巨大的潜力.本文从RNAi作为一种新的工具在哺乳动物整体水平应用研究的角度,对近一年来RNAi的载体策略、siRNA导入体内的方法,以及RNAi转基因动物等方面的研究进展作一综述.
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siRNA在治疗学中的应用
小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是外源性双链RNA(double strand RNA,dsRNA)的加工产物,在细胞内能介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)效应,识别特异性mRNA,沉默同源基因表达.其特异性和高效性显示出很高的实用价值,siRNA已成为许多疾病潜在的治疗手段.对于siRNA的应用,尽管还需要在减少非特异反应,发掘高效递药载体,应对新的基因变异等方面进行深入研究,但其可望在抗病毒、神经系统疾病和肿瘤治疗等许多领域发挥治疗作用.
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载短发夹RNA质粒的阳离子高分子脂质体载体的制备及理化性质的研究
目的 探索载短发夹RNA(shRNA)质粒的阳离子高分子脂质体(CPL)的制备方法及其理化性质,确定二者耦合的佳结合比,优化转染方案.方法 构建CPL,并对其进行表征,通过噻唑兰比色法检测CPL对细胞增殖的影响.将CPL与载shRNA质粒耦合,分为空白对照组(不做任何干预)、Lipofectamine2000转染组及不同质量比(1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)的质粒与CPL耦合成pCPL-shRNA组,转染人结肠癌细胞系HCT-116细胞,采用流式细胞仪检测载shRNA质粒的CPL的转染效率.结果 所构建的CPL为近球形、大小较一致、表面较光滑、分散性较好的纳米粒子,平均粒径为(95.58±4.21) nm.随CPL浓度增加,细胞抑制率逐渐升高,两者呈线性相关(R2=0.9851,P＜0.05),IC50=7.605× 10-2 g/L.载shRNA质粒与CPL在佳结合比为1∶2,转染效率为(28.19±5.38)％,优于转染剂Lipofetamine组(21.33±6.11)％(P＜0.05).结论 构建的载shRNA质粒的CPL是一种较为理想的基因转运载体.
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锌指转录因子Snai1通过E-钙黏蛋白调控胃癌侵袭及淋巴结转移
目的 探讨锌指转录因子Snai1在胃癌发生发展中的作用,以及胃癌组织中Snai1与E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的关系.方法 收集本院普外科2010年1月至2012年1月收治的65例胃癌患者手术切除的胃癌组织及邻近的正常胃黏膜组织,免疫组织化学检测Snai1和E-cadherin的表达.体外培养人胃腺癌细胞株SGC-7901,分为3组:空白对照组不进行转染,阴性对照组转染不含靶向作用于Snai1的siRNA的空质粒,转染组转染靶向作用于Snai1的siRNA.转染结束后实时定量PCR和免疫印迹法检测3组细胞Snai1和E-cadherin的表达.结果 胃癌组织中Snai1表达阳性率较正常胃黏膜组织明显增高(58.5％比0.0％,P＜0.001),而E-cadherin表达阳性率明显降低(43.1％比100.0％,P＜0.001).Snai1阳性和阴性的胃癌组织中E-cadherin表达的阳性率分别为28.9％ (11/38)、63.0％(17/27).Snai1阳性的胃癌患者较Snai1阴性的胃癌患者淋巴结转移率明显升高(78.9％比40.7％,P＜0.001).体外细胞实验显示,空白对照组与阴性对照组比较,Snai1和E-cadherin的表达差异无统计学意义(均P＞0.05)；与空白对照组比较,转染组Snai1 mRNA和蛋白表达下调,而E-cadherin mRNA和蛋白表达上调(均P＜0.05).结论 Snai1可通过抑制E-cadherin表达,促进胃癌发生局部浸润及淋巴结转移.
