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RNA干扰沉默CXCR4基因对Jurkat细胞周期和凋亡的影响
本文研究探讨下调CXCR4的表达对人T-ALL Jurkat细胞周期和凋亡的影响.设计合成CXCR4的特异性siRNA,采用脂质体转染Jurkat细胞株.用RT-PCR检测siRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况.结果表明:成功构建了CXCR4的特异性siRNA;与空白对照组相比,转染CXCR4 siRNA的Jurkat细胞的CXCR4 mRNA表达水平明显下降(56.9%±1.4%vs 68.3%±2.4%),G0/G1期细胞比例增加(35.8%±1.9% vs 18.1%±1.2%),G2/M期和S期细胞比例相应下降(19.8%±1.7% vs27.2%±1.5%;44.4%±2.1% vs 54.7%±2.8%),凋亡细胞率明显增高(20.9%±2.0% vs 3.13%±0.9%).结论:CXCR4的特异性siRNA能够有效下调CXCR4基因表达,诱导Jurkat细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖.
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慢病毒介导RNAi干扰β-catenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响
本研究通过构建β-连环蛋白(β-catenin)特异的RNAi慢病毒表达载体,探讨阻断Wnt/β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞(MSC)生物学行为的影响.设计3对针对β-catenin mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒PLB中,构建PLB-β-catenin/shRNA1,PLB-β-catenin/shRNA2和PLB-β-catenin/shR-NA3;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MSC细胞,并应用流式细胞术分选GFP阳性细胞,Western blot和RT-PCR验证其对细胞内β-catenin基因表达的抑制效果,筛选干扰效率高质粒;CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V/7-AAD法检测干扰后细胞凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell实验检测MSC迁移能力.结果表明:构建的特异性慢病毒siRNA干扰组(PLB-β-catenin/shRNA2)能有效抑制β-catenin的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞的增殖;而空载体对照组(PLB group)和正常对照组(control group)细胞增殖无明显变化,两组之间无显著的统计学差异(P＞0.05);流式细胞术检测结果显示,采用血清饥饿法处理后,干扰组细胞的凋亡率明显增加,但两对照组之间无统计学差异(P＞0.05);细胞划痕和Tran-swell实验显示,干扰组MSC的迁移能力明显降低,对照组细胞迁移能力无明显变化.结论:构建的特异RNAi慢病毒能够有效抑制β-catenin基因的表达,减少细胞内目的基因mRNA和蛋白的水平,从而对MSC细胞的增殖、凋亡和迁移能力产生重要影响.
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活化Chk1引起的G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨
本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响,探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制.以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为研究对象,与阿霉素共孵育后,用流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后,用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况.结果表明:阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞(36.99±1.28)%; Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异; Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56,在K562细胞为0.27 ± 1.47,其差异有统计学意义.转染Chk1shRNA后,两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降.转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍.结论: Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.
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bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究
为了探讨以bcl-2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl-2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,在G418筛选后应用Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化.结果表明:成功构建了bcl-2的小干扰RNA载体并转染HL-60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl-2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1.结论:bcl-2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性.
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Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体.针对已经筛选确定的kir2ds4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体,应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定.用LV-shkir2ds4,包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果表明,PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒栽体LV-shkir2ds4.293T细胞测定病毒滴度为6×10 8TU/ml.结论:成功地构建了人kir2ds4基因RNAi慢病毒载体.
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siRNA特异性抑制K562细胞Livin基因表达及其诱导凋亡作用
本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响.设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达.以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率.用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率.结果表明,电穿孔的转染效率可达50％.siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达.特异性siRNA转染细胞后48h细胞凋亡率为(27.41±2.30)％,与对照组(9.63±0.89％)比较明显提高(P＜0.05).结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用.
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RNA干扰法对内皮细胞基质金属蛋白酶-2功能研究
本研究运用RNA干扰(RNAi)技术将内皮细胞MMP-2进行基因沉默,揭示MMP-2在内皮细胞增殖、迁移、侵袭、血管形成以及细胞周期等方面的作用.采用脂质体法将MMP-2小干扰RNA(siRNA)转化内皮细胞EAhy926,通过RT-PCR及流式细胞术分别在基因和蛋白水平验证转化的效率.应用MTT比色法测定经MMP-2 siRNA干扰不同时间EAhy926细胞的增殖能力;虎红染色测定光密度法观察干扰48小时后内皮细胞在两种趋化因子作用下的迁移及侵袭能力的变化;Matrigel胶三维培养法观察干扰48小时后内皮细胞血管形成能力的改变;流式细胞术及半定量RT-PCR法测定内皮细胞周期和相关基因的变化.结果表明:干扰因素施加后48小时MMP-2基因表达水平降低至谷底,较正常对照下降约82%;流式细胞术分析表明,干扰因素施加后60小时MMP-2蛋白表达水平降低至谷底,较对照下降约60%.MTT法检测显示干扰前后内皮细胞增殖无明显变化.内皮细胞经MMP-2 siRNA干扰48小时后在两种趋化因子作用下的迁移能力均受到抑制,且时COL Ⅳ的抑制作用强于Fn(Fn 未干扰组0.581±0.012,干扰组0.261±0.002;COL Ⅳ未干扰组对干扰组为0.467±0.009 vs 0.110±0.010,p<0.01).侵袭实验也有相似的结果(Fn未干扰组对干扰组为0.365 4±0.012 vs 0.101±0.002;COL Ⅳ未干扰组对干扰组为0.317±0.009 vs 0.102±0.010,p<0.01).内皮细胞体外的血管形成能力在经siRNA干扰48小时后下降至正常的58.9%.内皮细胞经MMP-2 siRNA干扰48小时及72小时后,有丝分裂后期细胞比例(G1)分别由对照组[(65.9±2.53)%;(63.2±1.89)%]上升至[(83.9 4±2.53)%,(89.2 4±1.24)%](p<0.01);DNA复制期(S)和有丝分裂前期(G2)期细胞比例分别由对照组[(32.7±1.91)%,(37.1±2.65)%]下降至[(18.1±1.49)%,(10.2±0.85)%](p<0.01).半定量RT-PCR分析结果显示,内皮细胞Rb、cyclin D1以及PCNA基因表达量分别下降至未干扰者的35%,51%和22%.结论:MMP-2的表达与内皮细胞的增殖无明显相关性,但在内皮细胞迁移、侵袭和血管形成等方面发挥重要作用,同时还通过Rb、cyclinD1以及PCNA等基因参与内皮细胞周期的调控.
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shRNA干扰AKT基因对Jeko-1细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响
目的:探讨RNA干扰沉默AKT基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响.方法:设计针对AKT基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建AKTshRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,应用RQ-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白信号及通路相关蛋白p-AKT、Notch1、HES1的变化.结果:AKT shRNA转染Jeko-1细胞后,AKT的mRNA和蛋白表达均明显下降,有统计学意义(P＜0.05);转染组细胞增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组(P＜0.05),AKT shRNA传染48 h后,凋亡率为(37.72±4.39)％,而Neg-shRNA组和空白对照组分别为(2.62±1.53)％、(1.57±0.42)％,差异有统计学意义(P＜0.01);凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、caspase-3、caspase-9表达上升;PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT磷酸化水平下降、Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下调.结论:干扰沉默AKT基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是特异性抑制PI3 K/AKT信号通路也能下调Notch1信号通路的活性.
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序列特异性短发夹状RNA逆转白血病多药耐药性研究
本研究旨在构建并筛选MDR1序列特异性短发夹状RNA干扰载体,研究其对K562/A02细胞的影响.采用脂质体介导方法,将含mdr1-shRNA质粒转入K562/A02细胞,经G418筛选得到稳定表达细胞株,用实时定量RT-PCR和Western blot分别检测干扰后mdr1 mRNA水平及蛋白水平的表达变化,通过CCK8测定干扰后细胞对化疗药的敏感性变化,Rhodamine123外排实验检测P-gp功能的变化.结果发现:与对照组相比,4种MDR1-shRNA栽体均能显著下调P-gp的表达,其中508-526靶位点的shRNA作用效果好.结论:筛选得到的MDR1-shRNA载体能够显著下调MDR1的表达,逆转耐药表型,为后续进行的动物实验研究创立了条件.
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质粒介导RNAi靶向hTERT抑制K562细胞端粒酶活性的研究
本研究探讨质粒载体介导的RNAi靶向hTERT对白血病细胞株K562 hTERT基因封闭、端粒酶活性抑制的作用.针对hTERT mRNA化学合成3条siKNA链转染K562细胞,筛选2条高效特异的siRNA链,构建靶向hTERT mRNA的质粒载体pSUPER-U6-Kan r-hTERT-1、pSUPER-126.Kan r-hTERT-2,在脂质体介导下转染K562细胞;48、72小时后分析靶基因hTERT mRNA的表达量,检测细胞端粒酶活性,同时检测细胞凋亡率.结果表明:3条siRNA链中,48小时目的基因表达抑制,但抑制率有差异,72小时后抑制作用渐消失;转染质粒pSUPER-U6-Kan r-hTERT-1(P-1组)、pSUPER-U6-Kan r-hTERT-2(P-2组)的K562细胞hTERT rnRNA表达均下降,P-1组48小时时为0.39±0.13,72小时时为0.57±0.32,P-2组48小时时为0.55±0.20,72小时时为0.88±0.23;端粒酶活性P-1组48小时时为0.42±0.07,72小时时为0.31±0.08;P-2组48小时时为0.49±0.27,72小时时为0.39±0.03;两组均较阴性对照明显下降,且以P-1组作用明显.48小时细胞凋亡率P-1组为18.39±3.08%,P-2组为15.5±3.59%.与阴性对照组7.64±3.73%相比有显著性差异,72小时细胞凋亡率P-1组为13.2±1.18%、P-2组为12.86±3.09%,与阴性对照组8.07±0.19%相比无统计学差异.结论:靶向hTERT的RNAi可抑制目的基因hTERT mRNA表达,进而抑制端粒酶活性.此抑制作用与靶位点选择密切相关,实验中si-hTERT-1优于si-hTERT-2;si-hTERT-3几乎无作用.由质粒载体介导RNAi作用时间明显长于化学合成siRNA,前者72小时甚至更长,后者仅48小时.端粒酶活性被抑制后,48小时的细胞凋亡较对照组有所增加,72小时时与对照组无差别,推测端粒酶活性下调后部分细胞可能被诱导分化.
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FABP-5基因沉默对肝癌Bel-7402细胞生物学特性及人参川穹嗪敏感性的影响
目的 探讨通过siRNA干扰技术沉默表皮脂肪酸结合蛋白-5(FABP-5)基因表达对人肝癌Bel-7402细胞生物学特性及人参川穹嗪敏感性的影响.方法 以人肝癌Bel-7402细胞为研究对象,根据FABP-5mRNA 编码序列设计并合成干扰 siRNA 序列,瞬时转染Bel-7402 细胞.将人肝癌 Bel-7402 细胞分为 FABP-5 siRNA 组、阴性对照组、空白对照组.用 RT-PCR 和Western blot 法分别从 mRNA 水平和蛋白水平检测FABP-5 基因的表达;CCK8 法测定细胞体外增殖能力;流式细胞技术检测各组细胞周期和凋亡的变化情况;细胞侵袭小室法检测各组细胞的体外侵袭力;MTT 法观察 FABP-5基因沉默后 Bel-7402 细胞对人参川穹嗪的敏感性.结果 RT-PCR 和 Western blot 显示,FABP-5 siRNA 组较阴性对照组和空白对照组的 FABP-5 mRNA 和蛋白表达都明显下降;FABP-5 siRNA 组细胞的生长速度明显减慢,细胞周期阻滞在 G0/G1期,S 期细胞数减少;与阴性对照组和空白对照组相比,FABP-5 siRNA 组细胞的凋亡率明显升高(P < 0.01),增殖、侵袭能力显著下降(P < 0.05);FABP-5 siRNA组细胞对人参川穹嗪的敏感性显著增强(P < 0.05).结论 特异性沉默 FABP-5 基因表达能够降低肝癌细胞的侵袭能力,抑制细胞的增殖,将细胞周期阻滞于 G0/G1期,使其凋亡显著增加.
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载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究
目的构建和筛选能高效、特异性抑制人 GSK-3β基因表达的 siRNA 表达载体，探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。
方法提取人 L02细胞总 RNA，RT-PCR 扩增 GSK-3β基因序列，克隆至 pSEB-HUS 真核表达载体，构建 pSEB-G重组质粒。将设计、合成的3条靶向 GSK-3β基因编码区的 siRNA 及阴性对照分别克隆至 pSEB-G，构建 siRNA 表达载体 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G 及 pSEB-siN-G。将 siRNA 表达载体瞬时转染 HepG2细胞，通过绿色荧光信号、RT-PCR 和 Western blot 观察和检测其对 GSK-3β基因的抑制效果，MTT 实验和 caspase-3活性分析检测其对 HepG2细胞增殖和凋亡的影响。
结果经双酶切及测序证实，所构建 siRNA 表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染 HepG2细胞后，其中的 pSEB-si1-G 能使细胞中绿色荧光信号明显减少，可显著抑制 GSK-3βmRNA 的表达及蛋白的合成，并使 HepG2细胞增殖明显降低，caspase-3活性显著升高。
结论成功构建了靶向 GSK-3β基因的 siRNA 表达载体，沉默 GSK-3β能显著抑制 HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。 -
RNA干扰下调HE4基因表达对人卵巢癌SK-OV-3细胞增殖和侵袭的影响
目的应用 RNA 干扰技术下调人附睾蛋白 HE4基因表达水平，观察 HE4对人卵巢癌 SK-OV-3细胞增殖和侵袭能力的影响。
方法化学合成3对 HE4特异性小分子干扰 RNA （ siRNA ），脂质体法转染人卵巢癌细胞系 SK-OV-3（ HE4-siRNA 组），同时以非特异序列 siRNA 转染的SK-OV-3细胞（阴性对照组）和正常培养的 SK-OV-3细胞（正常对照组）为对照，于转染后48 h，采用实时荧光定量 PCR 技术（RT-qPCR）和 Western blot 方法分别检测HE4 mRNA 及蛋白表达水平。采用 CCK8试剂盒检测卵巢癌细胞增殖活性的变化，穿膜小室模型测定 HE4对细胞侵袭能力的影响。
结果与正常对照组相比，HE4-siRNA 转染卵巢癌SK-OV-3细胞48 h 后，HE4 mRNA 的表达水平显著下降，仅为正常对照组的12.7%（P<0.01），与之相应 HE4蛋白表达也显著下降，而转染非特异序列的阴性对照组与正常对照组之间的差异无统计学意义（P >0.05）。HE4-siRNA 下调卵巢癌 SK-OV-3细胞 HE4表达后，细胞增殖受到明显抑制，细胞增殖活性仅为正常对照组的60%，阴性对照组细胞增殖未见明显变化。体外侵袭实验显示，HE4-siRNA 组穿膜细胞数为每视野（21.8±2.86）个，显著低于正常对照组（187.4±11.17）个（P <0.01）和阴性对照组（177.8±9.76）个（P<0.01），而阴性对照组和正常对照组两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。
结论 HE4特异性 siRNA 能成功下调 SK-OV-3细胞中HE4基因的表达，显著降低卵巢癌细胞增殖和侵袭能力， HE4有可能成为人卵巢癌侵袭转移防治的重要靶点。 -
pGenesil-siHBV X对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果研究
目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA(siRNA)表达载体质粒pGenesil-siHBV X对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性.方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil-siHBV X.分别用培养液(空白对照)、脂质体Metafectene、pGenesil空载体、pGenesil-siHK(阴性对照)、pGenesil-siAFP(特异性对照)、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次.于每次转染后24 h,取各组细胞培养上清液,用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,用化学发光法检测AFP含量,用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平.结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达,且抑制作用随转染次数增加而增强.第3次转染后,pGenesil-siHBV X组细胞上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为(6.26±1.07)ng/ml、(0.13±0.05)Ncu/ml和(3.01±0.40)×107拷贝/ml,与空白对照组的(22.50±1.39)ng/ml、(1.12±0.11)Ncu/ml和(12.33±1.28)×107拷贝/ml比较,差异有统计学意义(t值分别为12.80、12.21、9.71,P＜0.05);pGenesil-siHBV X转染不影响细胞对AFP的表达(t=0.18,P=0.86).结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2.15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达.
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靶向MR-1基因shRNA表达载体的构建及其对白血病K562细胞增殖的抑制作用
目的 构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响.方法 以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4 DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体.将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westem blot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析.结果 成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误.将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株.细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低；细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低.结论 利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低.研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平.
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小RNA转染人外周血原代T淋巴细胞的转染试剂筛选
目的探讨人工合成 RNA转染人外周血原代 T淋巴细胞的有效方法。方法从人外周血分离原代 T淋巴细胞，采用 Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect和 EntransterTM-R 5种不同转染试剂介导荧光标记的 RNA转染原代 T淋巴细胞，通过荧光显微镜观察及流式细胞术检测进行转染效率评价。结果分离的人外周血原代 T淋巴细胞的纯度达到87.4%。采用上述5种转染试剂介导荧光标记的 RNA转染 T淋巴细胞，24 h后转染效率分别为（14.81±1.03）%、（14.33±1.24）%、（2.10±0.16）%、（1.69±0.08）%、（72.24±1.26）%。采用 EntransterTM-R转染100及50 nmol/L对照 RNA，24 h后转染效率分别为73.7%和56.0%；EntransterTM-R转染100 nmol/L对照 RNA后48、72 h荧光标记细胞阳性率分别为62.0%、56.6%。结论转染试剂 EntransterTM-R可有效介导人工合成 RNA转染人外周血原代 T淋巴细胞。
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基质金属蛋白酶2和9及血管内皮生长因子C在乳腺癌淋巴结转移中的作用
目的 研究血管内皮生长因子C(VEGF-C)与基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9在乳腺癌组织中的表达及三者在乳腺癌淋巴结转移中的作用.方法 应用免疫组织化学SP法对84例乳腺癌(有腋淋巴结转移者52例,无腋淋巴结转移者32例)的VEGF-C、MMP-2和-9以及血管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)的表达进行检测,统计分析VEGF-C、MMP-2和-9与乳腺癌淋巴管生成的关系.利用重组质粒表达载体介导的短发夹式干扰RNA(shRNA)靶向沉默乳腺癌MCF-7细胞株中VEGF-C基因,PCR检测VEGF-C、MMP-2和-9的表达.结果 VEGF-C与MMP-2和-9在乳腺癌组织中均呈过表达,分别为83.3%(70/84)、89.3%(75/84)和75.0%(63/84),且在腋淋巴结转移组[94.2%(49/52)、98.1%(51/52)和88.5%(46/52)]比无淋巴结转移组[65.6%(21/32)、75.0%(24/32)和53.1%(17/32)]明显高表达(P＜0.05);淋巴管密度在腋淋巴结转移组及无转移组的表达有统计学意义(P＜0.05),随着VEGF-C与MMP-2和-9表达强度增加,淋巴管数量也增加(P＜0.05);转染重组质粒后MCF-7细胞株的VEGF-C及MMP-2和-9的mRNA表达水平下调,抑制率分别为95.0%、53.0%和77.0%(P＜0.05).结论 VEGF-C与MMP-2和-9协同促进乳腺癌组织的淋巴管新生和乳腺癌淋巴结转移.
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KIAA0101在胃癌细胞中的表达及其对胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭力的影响
目的 研究胃癌细胞中KIAA0101蛋白的表达,并探讨其表达下调对胃癌MKN-45细胞增殖、细胞周期和侵袭力的影响.方法 利用Western blot检测3株胃癌细胞系(MKN-28、SGC-7901和MKN-45)中KIAA0101蛋白的表达.将KIAA0101小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA分别转染胃癌MKN-45细胞,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖的变化,利用流式细胞术检测细胞周期分布的改变,后采用Boyden小室检测细胞侵袭力的变化.结果 胃癌MKN-45细胞中KIAA0101蛋白的相对表达水平显著高于MKN-28和SGC-7901细胞,3组之间差异有统计学意义(P＜0.05).CCK-8结果显示,与未处理组和对照siRNA组相比,KIAA0101 siRNA组中胃癌MKN-45细胞的增殖受到明显抑制(P＜0.05).细胞周期分析结果显示,KIAA0101 siRNA组[ (61.47±0.89)％]在G0/G1期的细胞数比率显著高于未处理组[(47.43±0.85)％]和对照siRNA组[ (48.43±0.73)％；F=271.653,P=0.000].进一步Boyden小室体外侵袭实验结果显示,KIAA0101 siRNA组(61.51 ±4.76)中MKN-45细胞穿过Matrigel的细胞数显著低于未处理组(138.74±10.16)和对照siRNA组(132.93±11.25；F=65.949,P=0.000).结论 KIAA0101表达下调能明显抑制胃癌细胞的增殖、诱导细胞周期静止和降低细胞的侵袭能力,因而有望成为胃癌治疗的新靶点.
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siRNA沉默p75神经营养因子受体逆转胶质瘤恶性表型
目的 利用小干扰RNA(siRNA)技术沉默与胶质瘤细胞凋亡和侵袭密切相关的p75神经营养因子受体(p75NTR)基因,观察其逆转胶质瘤恶性表型的治疗效果.方法 设计靶向p75NTR基因的siRNA片段,脂质体转染人U251胶质瘤细胞系,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法 检测p75NTR的mRNA和蛋白表达;Transwell细胞侵袭实验检测U251细胞的侵袭力;软琼脂集落形成实验检测细胞集落形成能力;建立裸鼠颅内U251胶质瘤荷瘤模型,原位重复注射siRNA-p75NTR/脂质体复合物3次,MRI检测颅内瘤体积,免疫细胞化学SP法检测p75NTR、神经生长因子(NGF)和细胞周期蛋白(cyclin)D2表达,用TUNEL法做移植瘤细胞原位细胞凋亡检测.结果 转染siRNA基因片段的U251细胞p75NTR mRNA和蛋白质表达水平显著下降(P<0.05),细胞侵袭能力及软琼脂集落形成能力均显著降低(P<0.05);体内实验显示p75NTR的表达程度与NGF的表达呈正相关,与cyclin D2表达及原位细胞凋亡数量呈负相关,MRI示瘤体积增长缓慢,边界轮廓清晰,动物生存期明显延长(P<0.05).结论 靶向p75NTR的siRNA技术可有效降低胶质瘤细胞的侵袭及增殖能力,诱导肿瘤细胞凋亡.
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STK 15基因沉默导致胃癌细胞分裂停滞
目的探讨丝氨酸/苏氨酸激酶15 (serine/threonine kinase15, STK15) 基因在胃癌细胞有丝分裂中的作用.方法应用RNA干扰技术(RNAi)抑制胃癌细胞株MKN45细胞STK15基因表达;real-time定量PCR及Western blot检测干扰前后STK15 mRNA及蛋白质表达的变化;倒置显微镜观察MKN45细胞形态的变化;流式细胞仪检测细胞周期的变化;MTT法检测细胞增殖速度的变化;免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察MKN45细胞微管及有丝分裂表型的改变.结果 STK15基因沉默后,其 mRNA及蛋白质表达明显下降,real-time PCR结果显示,转染后48 h, STK15-组STK15 mRNA 水平较对照siRNA组的下降了89.54%;Western blot灰度比半定量检测显示,STK15蛋白水平较对照siRNA组降低了57.18%.较多MKN45细胞呈圆形改变并呈现G2期细胞的DNA含量, STK15-组3个时间点的圆形细胞占18.95%,而对照siRNA组为8.34%,差异有统计学意义 (P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,STK15-组G2期DNA含量细胞平均值为26.13%,而对照siRNA组G2期DNA含量细胞平均值12.46%(P<0.05).细胞增殖速度减慢(P<0.05).细胞有丝分裂表型发生改变(P<0.05).结论 STK15基因在MKN45细胞有丝分裂过程中可能起着关键作用,阻断其表达可导致MKN45细胞有丝分裂停滞.
