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RNA干扰及在刚地弓形虫研究中的应用
刚地弓形虫病严重危害人类健康,是非常严重的公共卫生问题,弓形虫病的防治刻不容缓,寻找安全有效的防治措施是控制弓形虫病的重点和难点.RNA干扰技术可以抑制特定基因的表达,具有普遍性、高效性、特异性等优点,是研究弓形虫基因组功能、筛选新的疫苗和药物靶点的强有力的工具.本文综述了近几年来RNA干扰的研究进展及其在刚地弓形虫研究中的应用.
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RNA干扰技术及其在血吸虫学研究中的应用
目前,血吸虫病仍然是许多国家和地区比较严重的公共卫生问题,寻找合适有效的防治方法是控制以至消灭血吸虫病工作的重点和难点.RNA干扰技术以其高效、特异、快捷地阻断特定基因的表达的优势,近年来已成为基因功能研究、基冈防治和寻找药物靶点的潜在的强有力工具.本文介绍了RNA干扰技术在血吸虫学研究中的应用,包括在血吸虫生活史的不同生长发育阶段、借助不同的载体等方法实施RNA干扰进行血吸虫相关基因的功能研究,以及对其抗感染和抗病治疗的效果进行评价,以助于血吸虫生长发育及致病的一些重要基因的功能研究,为探索防治血吸虫病的新方法提供一些思路.
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阴离子化高分子包覆非病毒载体提高有血清环境下RNA干扰效率的研究
大多数阳离子化高分子载体在血清环境中会大量吸附血清蛋白而导致转染效率低下,因而难以应用于临床.设计合成羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修饰富勒烯(C60-Dex-COOH)两种阴离子化高分子,并将其包覆在精胺化普鲁兰(Ps)与siRNA形成的复合物(PS/siRNA)外层,以减少复合物对血清蛋白的吸附.采用DLS/ELS检测阴离子包覆前后复合物的颗粒粒径及Zeta电位;用QCM-D验证阴离子包覆层的形成,并评价包覆层对牛血清白蛋白(BSA)吸附的影响;同时应用cck-8试剂、流式细胞术,检测包覆前后及不同包覆比例下复合物的细胞毒性、进入细胞的情况及对Hela-EGFP细胞的干扰效率.结果表明,Dex-COOH与C60-Dex-COOH能够在PS/siRNA外部形成稳定的负电性包覆层,有效阻止BSA的吸附,并在无血清的条件下显著降低复合物的细胞毒性;在有血清的环境中,表面包覆了阴离子化高分子的复合物可以不受血清蛋白的影响而被细胞大量摄取.对包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA复合物转染组施加光照,可促使复合物从溶酶体中逃逸,将血清条件下PS/siRNA的干扰效率提高20％.该策略可有效提高阳离子化高分子载体介导的RNA干扰效率.
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小RNA在血液肿瘤研究中应用的新进展
小RNA包括siRNA和miRNA两种,前者是伴随着RNAi现象发现的,是对外源基因剪切加工形成的,是生物维持自身基因组稳定性的一种机制.而miRNA是基因组中固有的,是在转录后水平调节基因表达的重要机制.小RNA的作用方式有两种:介导目标RNA降解和抑制蛋白质翻译.前者要求小RNA与目标RNA精确互补,而后者只要求部分互补,采取何种机制取决于互补程度而不是其来源.RNAi作为下调基因表达的手段,在功能基因组学中已有广泛的应用.对血液肿瘤发病相关基因,尤其对染色体易位造成的相关融合基因、凋亡相关基因及多药耐药基因的干扰研究表明,该技术不但是研究机制的有力手段,而且具有临床应用前景.对microRNA的研究发现,它在多种血液肿瘤如多种淋巴瘤和白血病中存在表达的变化,并与多种癌基因相关,提示它广泛参与血液肿瘤的发病机制.本文就RNA干扰和小RNA的发现和作用,以及小RNA在血液肿瘤研究中的应用作一综述.
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RNA干扰是静止基因表达的新方法
RNA干扰(RNAi)是一种封闭基因表达的有效方法,通过小干扰RNA片段(siRNA)启动细胞内的RNAi反应,显著增加对目标mRNA的表达抑制.本文综述了RNAi机理,哺乳动物细胞siRNA靶点选择,以及siRNA载体构建和转染哺乳动物体细胞的研究现状.
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沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病KG-1细胞凋亡的影响
本研究旨在探讨沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病细胞株KG-1增殖和凋亡的影响.将SUV39H1 siRNA经LipofectamineTM2000转染至KG-1细胞,应用MTS法检测细胞增殖率,观察SUV39H1 siRNA对KG-1细胞增殖的影响；流式细胞术分析细胞凋亡；Western blot检测SUV39H1 siRNA作用后P15和凋亡相关蛋白BCL-2、prcaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达.结果表明,沉默SUV39H1基因可抑制细胞增殖,SUV39H1 siRNA浓度为30、60、120、240 nmol/L作用48 h后,KG-1细胞的增殖率分别为(76.43±1.98)％、(51.31±1.84)％、(37.31±1.61)％、(18.94±3.22)％,差异具有统计学显著意义(P＜0.05)；SUV39H1 siRNA可上调P15基因的表达；SUV39H1 siRNA可诱导细胞凋亡,30、60、120 nmol/L SUV39H1 siRNA作用48 h后,KG-1细胞凋亡率分别为(40.2±5.1)％、(56.8±4.8)％、(71.6±5.6)％,差异有统计学显著意义(P＜0.05)；抗凋亡相关蛋白BCL-2、prcaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达减少.结论:SUV39H1 siRNA能抑制KG-1细胞的增殖并诱导其凋亡,有望成为白血病治疗的一个新的靶点.
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慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究
P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用.针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性.P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点.本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/abl shRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用.用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力；用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/abl mRNA和蛋白的表达.结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/abl shRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50％以上.将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210 bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长.结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果.
关键词： 慢性髓系白血病 P210bcr/abl融合基因 RNA干扰 慢病毒载体 -
BCR/ABL特异性siRNA真核表达载体构建及其对K562细胞的影响
目的:构建特异性BCR/ABL的siRNA真核细胞表达载体并探讨其对K562细胞BCR/ABL的干扰和生长增殖的影响.方法:根据GenBank数据库提供的BCR/ BAL基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA (Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117和pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;该载体带有zeocin药物抗性和受四环素(tet)调控的开关基因,通过Lipofectamine 2000转染K562细胞,并筛选出阳性K562细胞克隆.采用TaqMan real-time quantitative RT-PCR (RQ-PCR)和Western blot技术检测BCR/ABL mRNA和P210蛋白表达;台盼蓝染色法观察细胞的生长增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡.结果:构建BCR/ABL融合基因siRNA真核表达载体pTER117和pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致.用筛选出重组载体转染阳性K562细胞克隆,经过四环素诱导基因表达后,细胞的生长增殖明显受到抑制;pTER117和pTER363诱导K562细胞48 h和72 h后,其凋亡率分别为34.4％、31.8％和58.1％;54.6％;BCR/ABL的mRNA表达明显下调,分别为诱导前的10％、18％和8.5％、16％;P210蛋白表达下降明显,几乎检测不到表达.结论:BCR/ABL融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞BCR/ABL的表达,抑制细胞生长,诱导细胞调亡.
关键词： 慢性髓系白血病 Bcr/abl融合基因 真核表达载体 RNA干扰 K562细胞 -
干扰CXCR4抑制急性单核细胞白血病细胞株SHI-1黏附、侵袭及成瘤能力
目的:研究干扰人趋化因子受体4 (CXCR4)基因表达对白血病细胞株SHI-1细胞体外增殖、黏附、侵袭能力及裸鼠皮下成瘤能力的影响.方法:通过构建干扰CXCR4表达的慢病毒载体,重组病毒颗粒感染SHI-1细胞,干扰SHI-1细胞CXCR4表达,定量PCR检测CXCR4、MMP-2和MMP-9表达;流式细胞术检测SHI-1细胞膜表面CXCR4蛋白表达;MTT法检测细胞体外增殖能力;将SHI-1等与骨髓基质细胞共培养,检测SHI-1细胞黏附能力及跨Matrigel基质胶迁移能力;将白血病细胞SHI-1接种于裸鼠皮下并观察其在裸鼠皮下生长情况.结果:干扰CXCR4表达的慢病毒颗粒感染SHI-1细胞后,SHI-1/CXCR4i细胞的CXCR4 mRNA表达较感染阴性对照病毒的SHI-1/NC细胞下调76％,SHI-1/CXCR4i细胞膜表面CXCR4表达明显下调;SHI-1/CXCR4i细胞MMP-2、MMP-9表达分别也分别下降63％和62％;SHI-1/CXCR4i细胞体外增殖能力无显著改变,但其黏附能力及跨Matrigel基质胶迁移能力明显下降;SHI-1/CXCR4i细胞不能在裸鼠皮下形成肿瘤,而SHI-1及SHI-1/NC细胞均能在裸鼠皮下形成肿瘤,且肿瘤体积无显著差异.结论:干扰CXCR4表达可使SHI-1的黏附、移行能力显著下降,并能完全抑制SHI-1在裸鼠皮下形成肿瘤,CXCR4可作为白血病治疗的一个靶点.
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shRNA干扰NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Akt/mTOR信号通路的影响
本研究旨在探讨RNA干扰沉默NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响.针对NOTCH1基因设计短发夹RNA并将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建NOTCHl shR-NA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞;应用RT-PCR及Westem blot鉴定其干扰效果,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、procaspase-3、procaspase-9及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达.结果表明:NOTCH1 shRNA转染Jeko-1细胞后,NOTCH1基因的mRNA和蛋白表达均明显下调,有统计学差异(P＜0.05);转染组增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白组(P＜0.05),NOTCH1 shRNA转染48 h后,凋亡率为(34.58±3.46)％,而Neg-shRNA组和空白组分别为(2.44±1.35)％、(1.72±0.64)％,有统计学差异(P＜0.05);凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-3、pro-caspase-9的表达下调,而BAX表达上调;干扰NOTCH1基因后Akt总蛋白未见明显变化,而p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达下降.结论:干扰沉默NOTCH1基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过去磷酸化抑制Akt/mTOR信号通路可能是其机制之一.
关键词： 套细胞淋巴瘤 Notch1基因 RNA干扰 Akt/mTOR信号途径 -
小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Flt-1基因表达的抑制作用
本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长因子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制.采用脂质体介导的方法将构建的人fit-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用G418抗性筛选获得阳性克隆:抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT-PCR和免疫印迹反应检测flt-1 mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT-PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达.结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt-1基因和蛋白在细胞中的表达,两组阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46.1%和65.4%;flt-1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力(4.3±1.2)%较对照组(12.7±1.9)%及(9.6±1.7)%明显降低(p＜0.01).结论:VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转柒入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平下降.这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移.
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沉默DNMT1基因对骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化的影响
目的:探讨DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase,DNMT1)基因沉默对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞内细胞因子信号转手抑制分子1(suppressor of cytokine signaling,SOCS-1)甲基化的影响.方法:应用靶向沉默DNMT1基因的短发卡RNA(RNA-Short hairpin RNA,shRNA)通过脂质体(lipofectamineTM2000)介导转染骨髓瘤细胞RPMI8226,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测转染前后DNMT1基因和蛋白表达,应用甲基化特异性PCR检测转染前后骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化水平的变化.结果:转染后骨髓瘤细胞DNMT1 mRNA表达水平(0.176±0.004)和蛋白表达水平(0.065±0.014)均明显低于阴性对照组(0.956±0.033,0.415 ±0.027),其差异具有统计学意义(P＜0.01).转染后SOCS-1基因甲基化水平较转染前明显降低.结论:利用shRNA能靶向沉默DNMT1基因的表达,并可以有效逆转SOCS-1基因高甲基化状态.
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NPM1基因沉默的HL-60及其耐药细胞株的建立
本研究旨在构建针对HL-60细胞及其耐药细胞株(HL-60/ADR)的NPM1-RNAi的细胞模型,为研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用奠定实验基础.通过针对NPM1基因的shRNA与线性化的pGCSIL-GFP 载体进行连接转化,对获得的重组子(pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA)进行PCR和测序鉴定.采用慢病毒载体系统将pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体与pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA共转染293T细胞,包装成NPM1 -RNAi-LV,将慢病毒载体感染HL-60及HL-60/ADR细胞.采用实时定量RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证建立的细胞株的转染效率.结果表明,成功构建了重组真核表达载体pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA,并通过慢病毒载体系统包装成NPM-1-RNAi-LV;将NPM1-RNAi-LV转染至HL-60及HL-60/ADR细胞后,从mRNA水平上看,对细胞的NPM1 mRNA表达有显著抑制,达到90％以上(p＜0.05);从蛋白水平上看,对细胞的NPM蛋白表达具有显著的抑制效果,表明转染后的HL-60及HL-60/ ADR细胞的NPM1基因特异性沉默.NPM1基因沉默后,HL-60/ADR对阿霉素的耐药性有一定程度的下降.结论:成功构建了NPM1-RNAi的HL-60及HL-60/ADR细胞模型,为进一步研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用建立了良好的实验基础.
关键词： HL-60细胞 HL-60/ADR细胞 核磷酸蛋白 RNA干扰 慢病毒载体 -
特异性抑制Aqp1基因对K562细胞生长的抑制作用
本研究探讨靶向aqpl(aquaporin 1)基因的siRNA对K562细胞生长的抑制作用.设计siRNA,转染K562细胞,在相差显微镜观察细胞形态变化;用MTT法观察aqpl-siRNA对K562细胞活力的影响;使用流式细胞仪、DNA片段化分析K562细胞凋亡;用RT-PCR半定量检测转染前后aqp1基因表达.结果表明:苏木素-伊红染色后,细胞呈现明显的凋亡形态;转染24小时后aqp1-siRNAs对K562细胞的活性有显著抑制作用;aqp1-siRNA转染K562细胞后可见明显的凋亡峰,24、48和72小时的细胞凋亡率持续上升,分别为24.2%、36.1%和42.9%;48小时后aqp1-siRNA组出现明显的DNA凋亡"梯形电泳带";aqp1基因的表达水平在aqp1-siRNA转染后24、48和72小时,分别减少了33%、46%和57%.结论:aqp1-siRNA能够抑制K562细胞的增殖.诱导其凋亡,可作为治疗恶性肿瘤的新靶点.
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小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选
本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,观察其对Qa-1基因的沉默作用,筛选出有效靶位.通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具,选择3段针对Qa-1的siRNA,交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒,采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞,第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒,第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照,收集转染后24、48、72小时的细胞,用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa-1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析,筛选有效的干扰片段.结果表明:成功构建了3个针对小鼠Qa-1的小发夹表达质粒.RT-PCR及流式细胞术检测证实,转染后3个组shRNA我体均可抑制Qa-1基因的表达,但抑制程度不一:24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231:60.9%,81.9%,43.6%;H2-T232为:64.5%,73.9%,61.1%;H2-T233为:61.9%,71.2%,47.5%.其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均明显.结论:构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达,其中H2-T232具有有效抑制作用.
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FLT3靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成及作用
FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)是一种酪氨酸激酶受体,在大多数急性髓系白血病(AML)患者中持续激活,与患者预后差密切相关.为探讨3种FLT3靶向短发夹状干扰RNA(shRNA)对急性髓系白血病细胞株THP-1的沉默效应,设计和体外转录合成3个FLT3靶向shRNA(shRNA1、shRNA2、shRNA3),体外转染THP-1细胞;以RT-PCR法检测FLT3 mRNA水平表达,用流式细胞术、免疫荧光测定法检测FLT3蛋白的表达.结果显示:shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3 mRNA的表达,其中shRNA1的抑制作用较强.25 nmol/L shRNA1转染48小时对FLT3 mRNA的抑制率是(72.95±2.07)%,作用可达72小时.5 nmol/L及以上浓度的shRNA1对FLT3 mRNA表达有下调作用,作用存在量-效关系.15 nmol/L shRNA1的抑制率是(67.53±0.66)%.FLT3蛋白位于细胞膜上,shRNA1对其有较强的抑制作用,转染72小时蛋白抑制率达(79.67±0.66)%.结论:FLT3-shRNA1具有较好的FLT3基因靶向抑制作用,可作为进一步研究该基因作用机制及靶向治疗可能性的工具.
关键词： 急性髓系白血病 Flt3 FLT3-shRNA RNA干扰 THP-1细胞株 -
Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体的构建及生物活性鉴定
本研究构建Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体,为探讨抑制Fas表达在再生障碍性贫血等疾病治疗中的意义、以及为促进RNA干扰技术的广泛开展奠定基础.用PCR方法获得小鼠U6+27启动子盒及产生siRNA的相应DNA模板,然后连同增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆入商业化逆转录病毒载体pLXSN,以获得逆转录病毒载体穿梭质粒pLXSN/EGFP-siFas.包装、滴定重组逆转录病毒载体,并感染P815细胞,检测绿色荧光蛋白表达情况及对细胞Fas表达的抑制情况.结果表明:构建的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-siFas能够有效被包装并感染靶细胞,在靶细胞内可同时表达siRNA、绿色荧光蛋白以及新霉素抗性.结论:成功构建了抑制小鼠Fas表达的RNA干扰逆转录病毒载体.
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Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立
本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-1i稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础.设计、合成1对针对Bmi-l mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株；应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较.结果表明,成功构建了针对Bmi-l基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5 ×107 TU/ml；建立稳定转染的U266细胞株.有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-l的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株.
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靶向TNF-α基因shRNA干扰片段的筛选和重组体的构建
本研究利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建重组质粒,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,置于15%DMEM中,调细胞浓度为2×107/L,接种于6孔板,3 ml/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24小时后用ELIsA法测培养上清中TNF-α的浓度,RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒裁体,转化E.coli DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析.结果表明:LPS刺激巨噬细胞24小时后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度与对照组相比下降明显(P＜0.05),达59.46%,TNF-αmRNA的表达被抑制了61.2%;将干扰序列1 DNA序列克隆到裁体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新手段.
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RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响
本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用.以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern b1ot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用.结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株.流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%).MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p＜0.01和p＜0.05).结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡.RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用.
关键词： RNA干扰 BCR-ABL融合基因 p27基因克隆 K562细胞
