首页 > 文献资料
-
血管细胞黏附分子-1增强人脑胶质瘤细胞系迁移和侵袭能力
目的：探讨血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）在脑胶质瘤细胞迁移侵袭能力中作用。方法用慢病毒pSGU6／GFP／Neo介导VCAM-1的shRNA、慢病毒EF1a-GFP／puro介导VCAM-1过表达载体、划痕迁移、Transwell 侵袭、蛋白免疫印迹（Western blot）和细胞染色等实验技术和方法，观察了VCAM-1蛋白表达水平对人脑胶质瘤T98G和U251细胞系细胞迁移和侵袭能力的影响。其中，T98G细胞分为空白对照组、空载体对照组、乱序对照组和实验组（抑制VCAM-1蛋白表达水平组），U251细胞分为空白对照组、空载体对照组和实验组（过表达VCAM-1组），每组6个复孔。结果首先利用慢病毒介导VCAM-1的shRNA和过表达载体建立了稳定低表达VCAM-1的T98G细胞和稳定过表达VCAM-1的U251细胞。稳定低表达VCAM-1的T98 G细胞划痕恢复能力（迁移能力）明显减弱（ P＜0.01）；而稳定过表达VCAM-1的U251细胞迁移能力明显提高（P＜0.05）。同样，稳定低表达VCAM-1的T98G细胞侵袭能力显著减弱（ P ＜0.05）；而稳定过表达 VCAM-1的 U251细胞侵袭能力明显增强（ P ＜0.01）。结论VCAM-1可显著增强人脑胶质瘤细胞系细胞的迁移和侵袭能力。
关键词： 血管细胞黏附分子-1 脑胶质瘤 慢病毒转染 迁移能力 侵袭能力 -
p38-2 G4蛋白高表达对小鼠红白血病细胞增殖和分化的影响
目的：探讨小鼠增殖相关蛋白p38-2G4基因表达上调对小鼠红白血病（ MEL）细胞增殖和诱导分化能力的影响。方法构建 p38-2G4-pLJM1高表达重组载体与 pCMV-VSV-G 和 pCMV-dR8．2包装质粒共转染HEK293T细胞慢病毒，感染MEL细胞，建立稳定高表达p38-2G4蛋白的MEL细胞系，Western blotting 检测稳定株p38-2G4蛋白的表达。 MTT实验和联苯胺染色法检测p38-2G4蛋白高表达对MEL细胞增殖和诱导分化能力的影响。结果高表达稳定株中p38-2G4蛋白表达量明显高于对照组细胞（P＜0．05）。 p38-2G4蛋白的高表达能显著影响MEL诱导分化过程，导致血红蛋白合成减少（ P＜0．05），但不能明显改变细胞活力（ P＞0．05）。结论 p38-2G4蛋白的高表达对MEL细胞增殖无明显影响，但能显著影响其被丁酸钠诱导分化的过程。
-
RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR(Real-time PCR)检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V(Annexin V)染色并用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74％;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加.结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡.
-
大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立
本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞.无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC.结果表明,贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMMSC,细胞呈均一的成纤维细胞样;流式细胞术显示,第4代BMMSC中CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性.在相应的诱导培养条件下,BMMSC均能成骨及成脂分化.BMMSC用慢病毒液转染后表达GFP.结论:贴壁培养法简单、可行和稳定;分离培养的细胞具有BMMSC的生物学特性和多向分化潜能;BMMSC经慢病毒液转染后表达GFP,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,适合体内示踪.
-
HLA-G慢病毒转染抑制NK细胞毒功能的实验研究
目的 建立一株稳定表达人类白细胞抗原G(human leucocyte antigen G,HLA-G)的子宫内膜癌细胞系,探讨HLA-G对NK92细胞的杀伤活性影响.方法 将HLA-G慢病毒包装并转染于HEC-1-B细胞系,稳定转染HLA-G基因的HEC-1-B与NK92细胞系共培养,并使用乳酸脱氢酶(lactate dehydrognase,LDH)释放法检测HLA-G表达对自然杀伤(natural killer,NK)92细胞杀伤活性的影响.结果 外源基因HLA-G成功介导转染在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞系,通过免疫荧光可见HLA-G表达率为95％,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测HLA-G基因表达能够有效抑制NK92细胞的杀伤活性,与对照组相比有统计学意义(P<0.05).结论 HLA-G是一个重要的免疫抑制分子,稳定表达HLA-G的子宫内膜癌细胞可明显抑制NK92细胞的杀伤活性,可能诱导移植免疫耐受的发生.
-
LIF基因慢病毒载体构建及其在人脂肪间充质干细胞的表达
目的 构建LIF慢病毒载体,转染人脂肪间充质干细胞,以此获得高表达LIF的人脂肪间充质于细胞,为LIF在人脂肪间充质干细胞介导的免疫调节效应机制研究中奠定基础.方法 以PCR扩增得到LIF基因序列,采用质粒重组技术获得载有LIF基因的重组质粒,然后用重组质粒包装慢病毒.用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞,然后将慢病毒转染人脂肪间充质干细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,采用流式细胞技术检测慢病毒转染率,RT-PCR及Western blot技术检测LIF的表达水平,后经SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析,计量资料均以((x)±s)表示,组间均数比较采用成对样本t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 通过PCR技术扩增得到LIF基因序列,并且成功构建带有LIF基因的重组质粒,重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定,得到大小为608 bp左右的条带,大小与LIF基因序列匹配,通过重组质粒转染293T细胞后获得慢病毒颗粒,滴度检测达1×108 TU/ml.成功分离得到纯度高的hASCs,慢病毒转染hASCs后,流式细胞仪检测慢病毒转染率可达90％.RT-PCR及Western blot结果经统计学分析提示,转染后LIF的表达水平明显升高.结论 携带人LIF基因的慢病毒载体可以有效转染hASCs,并且表达LIF.
-
Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化
背景:Scleraxis作为肌腱细胞特异性表达分子,不仅参与肌腱祖细胞的聚集及分化,还影响肌腱细胞外基质的形成.人羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨及其他结缔组织.目的:探讨Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞能否向肌腱细胞定向分化并观察其分化效果.方法:取足月产胎盘羊膜组织,两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞并采用倒置相差显微镜观察和流式细胞鉴定.取第3代细胞分3组进行培养,单纯人羊膜间充质干细胞培养组为空白组,人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染后为过表达组,人羊膜间充质干细胞经不携带Scleraxis基因慢病毒感染后为空质粒组.细胞培养7 d内CCK-8法检测各组细胞增殖能力细胞.细胞培养后3 d和7 d,分别进行实时荧光定量PCR和Western Blot检测评价各组细胞向肌腱细胞定向分化的效果.结果与结论:①CCK-8检测显示:培养7 d内,过表达组、空质粒组与空白组细胞在增殖能力上无明显差异(P>0.05);②Westen blot检测显示:过表达组Scleraxis蛋白表达水平明显高于空质粒组和空白组(P<0.05);③实时荧光定量PCR显示:3 d时,过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白及肌腱蛋白C mRNA表达水平明显高于空质粒组(P<0.05),而腱调蛋白的表达与空质粒组无明显差异(P>0.05);7 d时,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及腱调蛋白的表达水平明显高于空质粒组(P<0.05);④结果提示:人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒基因感染后可向肌腱细胞定向分化.
-
骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖
背景:骨桥蛋白是一种细胞外多功能基质糖蛋白,已被证实参与调控骨关节炎软骨细胞外基质成分的合成分解代谢,但对于骨关节炎软骨细胞本身增殖能力的影响,报道较少.目的:观察骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞增殖能力的影响.方法:所有软骨标本均取自湘雅医院于2012年1至6月因骨关节炎行膝关节置换患者,分离培养骨关节炎软骨细胞,分别予以骨桥蛋白干预、骨桥蛋白shRNA慢病毒转染、空白对照及Con-shRNA转染等处理,利用MTT及BrdU法检测细胞的增殖能力变化.结果与结论:①骨桥蛋白shRNA慢病毒对骨关节炎软骨细胞转染率为80%;②与对照组相比,骨桥蛋白干预可明显上调骨关节炎软骨细胞吸光度值(P<0.05),而骨桥蛋白shRNA慢病毒干扰组吸光度值则显著下降(P<0.05);③骨桥蛋白shRNA转染后,骨桥蛋白的表达水平显著下降(P<0.05);④结果表明骨桥蛋白可促进骨关节炎软骨细胞增殖,有望成为治疗骨关节炎的新靶点.
-
慢病毒介导NGF过表达转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究
目的 探究慢病毒介导神经生长因子(NGF)过表达转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的作用.方法 体外分离,培养人BMSCs,利用基因过表达技术,构建NGF过表达慢病毒载体转染BMSCs.根据转染情况分成3组,空白对照组(未转染慢病毒载体的BMSCs)、空白载体病毒组(转染不含NGF过表达慢病毒载体的BMSCs)和过表达载体病毒组(转染过表达NGF慢病毒载体的BMSCs).利用流式细胞仪检测BMSCs的表面标记物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别检测神经细胞表面蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE) mRNA及蛋白的表达.结果 (1)BMSCs的表面蛋白标记物CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2％和58.3％,CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4％和2.6％.(2)慢病毒转染效率为90％以上.转染效率较高.(3)空白对照组、空白载体病毒组和过表达载体病毒组的GFAP和NSE mRNA的相对表达量三组比较有统计学差异(P＜0.05);其中空白载体病毒组和空白对照组的组间比较无统计学差异(P＞0.05);过表达载体病毒组高于空白载体病毒组,组间比较有统计学差异(P＜0.05).Western blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点.结论 慢病毒介导NGF过表达转染促进BMSCs可以提高BMSCs向神经细胞转化的效率,可以为神经损伤和脊髓损伤提供种子细胞.
-
大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应
目的 构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响.方法 设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染人293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组).RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况.结果 与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P＜0.01或P＜0.05).结论 成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体.其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加.
关键词： Neuritin基因 shRNA载体 慢病毒转染 雪旺细胞 凋亡 -
miR-21诱导犬BMSCs骨向分化的体外实验研究
目的 体外研究检测miR-21诱导拉布拉多犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用.方法 构建LentimiR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体,分别转染犬BMSCs,将研究分为miR-21组与LacZ组.利用体外细胞划痕实验来比较转染后BMSCs的爬行迁移能力.在转染后的第0、1、4、7、14天分别提取miR-21组与LacZ组BM-SCs的mRNAs和蛋白.通过Real time-PCR技术和Westernblot检测成骨分化关键因子骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达.结果 Lenti-miR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体成功转入BMSCs后,miR-21组的BMSCs细胞爬行迁移能力显著增强(P＜0.001);Real time-PCR和Western blot结果显示,miR-21可以显著上调BMSCs成骨分化关键因子OCN和OPN的表达(P＜0.05).结论 miR-21可以显著促进BMSCs的成骨分化,为进一步的体内实验奠定基础.
-
HIF-1α基因介导的牙髓干细胞在体外的成血管作用
目的 探索低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因诱导牙髓干细胞(DPSCs)在体外的成血管作用.方法 对HIF-1 α进行基因突变,构建突变型、野生型以及对照组的慢病毒载体;体外培养DPSCs;分别用3种慢病毒转染DPSCs后,检测细胞转染效率、目的基因HIF-1d在mRNA及蛋白水平的表达,MTr法检测慢病毒载体对细胞增殖的影响;目的基因转染成功后,qPCR、Western blot法检测HIF-1 α调控DPSCs成血管因子的表达.结果 MTT结果表明慢病毒载体对DP-SCs的增殖几乎无影响.qPCR和Western blot法检测目的基因HIF-1α成功表达,HIF-1α能够显著上调DPSCs的成血管因子的表达(P＜0.05).突变组和野生组的成血管作用明显强于对照组(P＜0.05),而突变组又优于野生组(P＜0.05).结论 HIF-1 α基因可以促进DPSCs血管向分化作用.
-
神经干细胞静脉移植对大鼠脊髓损伤的修复作用
制备阴性对照病毒转染的传代神经干细胞( NSCs ),同期制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为实验组、假手术组、空白组,并对其进行术后行为学评分。3d后取实验组再次手术,尾静脉输注已用阴性对照病毒标记的大鼠NSCs浓缩液。于1周和6周时对假手术组、实验组大鼠行10%福尔马林灌注,以固定的大鼠脊髓段落,福尔马林浸泡存放去除的脊髓段1 d,石蜡包埋后切片。获得大量尚未分化、悬浮生长的NSCs球。完成NSCs的传代。实验组的行为学评分结果比假手术组分值高。实验组大鼠脊髓损伤区脊髓空洞体积较假手术组小。初步证明注射NSCs液的大鼠恢复速度高于假手术组和空白组,NSCs移植能够减小脊髓损伤处的空洞体积和促进血管生长,从而促进脊髓损伤后神经功能的恢复。
-
小鼠脂肪源间充质干细胞的培养鉴定及增强绿色荧光蛋白-慢病毒载体转染
目的 探索脂肪源间充质干细胞(A DMSCs)的分离培养方法、生长特性及筛选出慢病毒载体感染间充质干细胞的佳感染指数(MOI),并鉴定其感染后的增殖能力,为ADMSCs移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据.方法 取4周龄昆明小鼠腹股沟脂肪组织,差速贴壁法培养分离昆明小鼠脂肪源间充质干细胞.经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5％ CO2孵箱中培养,24h后换液,以后每3d更换培养基,待细胞融合达到约90％时,传代培养.取第3代ADMSCs用流式细胞术(FCM)检测其表型、茜素红染色及油红O染色鉴定其多向分化潜能;用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体(LV)感染ADMSCs,FCM检测病毒感染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染后的细胞活力.结果 (1)差速贴壁法培养分离7～11d时细胞融合达80％以上.原代细胞融合达80％～ 90％进行1:4传代,细胞贴壁和生长速度快于原代细胞培养.第3代及再传代细胞形体趋于一致,细胞呈梭形.细胞连续传代10次,生长速度未见明显减缓;(2) FCM检测第3代细胞CD29阳性表达98.93％,CD34阳性表达0.17％;(3)第3代细胞成脂诱导14 d油红O染色阳性,成骨诱导14 d茜红染色阳性;(4)当MOI=25感染第3代细胞72 h后,共聚焦荧光显微镜观察细胞EGFP阳性表达60％ ～ 70％,细胞活力不受影响;(5) MTF法显示重组慢病毒转染细胞与未转染慢病毒细胞比较,细胞增殖能力无差异.结论 从昆明小鼠腹股沟脂肪组织中分离的ADMSCs可在体外稳定传代;差速贴壁法可以简便、高效地提取ADMSCs;携带EGFP的LV可有效感染ADMSCs,并且感染后其增殖能力不受影响.
-
FGFR4基因沉默对肝癌细胞生物学行为影响机制分析
目的:研究FGFR4基因沉默对肝癌细胞生物学行为影响.方法:采用FGFR4表达较高的肝癌细胞株smmc-7721,采用慢病毒转染降低smmc-7721 中FGFR4的mRNA和蛋白表达水平.设A组为未进行转染操作的正常细胞组,B组为FGFR4基因序列被打乱后重组的阴性对照组,C组为经慢病毒转染后的FGFR4基因沉默(siRNA)组.对比三组细胞的增殖能力、凋亡情况、侵袭能力以及相关效应蛋白的表达情况.结果:C组细胞增殖明显低于A组和B组,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞穿出计数对比,A组(59.8 ±3.17)和B组(61.5 ±4.26)均显著高于C组(36.8 ±5.13),差异有统计学意义(P＜0.05);C组细胞凋亡显著高于A组和B组,差异有统计学意义(P＜0.05);C组FLIP、PCNA、Bcl-xL、pERK、pSTAT3、Vimentin和FGFR4的蛋白表达均显著低于A组和B组,而Caspase-3和E-cadeherin的表达则显著高于另外两组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:FGFR4 沉默后,肝癌细胞smmc-7721 的增殖能力受到了显著的抑制,癌细胞侵袭性明显下降,肝癌细胞的凋亡率显著上升.
-
红/绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞在骨支架中的示踪及转归
目的 比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别转染红/绿色荧光蛋白(RFP/GFP),作为种子细胞在消旋聚乳酸(PDLLA)支架上贴附、增殖、代谢和分化的不同.方法 以佳感染复数(MOI)的Lentivirus-GFP/RFP转染BMSCs,成骨诱导培养后接种于PDLLA骨支架,分为GFP-BMSCs(G组)、RFP-BMSCs(R组)、未经转染的BMSCs作为对照(Control,C组).检测并比较各组种子细胞的代谢活性、贴附、增殖、荧光示踪与成骨分化.结果 G组BMSCs代谢活性持续增强,培养21 d时荧光强度达20 458±1 364;而R组BMSCs代谢活性在培养14 d时达顶峰(12 216±742),培养21 d急剧下降至7 865±1 031.荧光显微镜及扫描电镜下观察,G组与R组BMSCs均能在PDLLA支架上贴附与增殖,G组的增殖、贴附及细胞生长状态明显优于R组.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)结果显示:随着培养时间延长,各组成骨相关基因骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)的表达均上调,G组和C组表达倍数变化近似,各时间点各基因表达均高于R组(P＜0.01).G组和C组的OCN、ALP和OPN表达均在第21天达到高峰;R组OCN、ALP表达以第14天为高峰(分别为6.00±1.44与2.14±0.58),OPN表达第7天为高峰(5.91±1.20),各基因表达至第21天均明显下调.结论 BMSCs转染GFP,在PDLLA支架上贴附、增殖、代谢和成骨分化均优于转染RFP.
-
过表达微小RNA-223脊髓来源神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-223是否通过靶基因RhoB调控脊髓继发炎症性损伤,观察过表达miR-223脊髓来源神经干细胞(NSCs)移植的治疗作用.方法 以佳感染复数(MOI)为10的慢病毒载体系统转染NSCs并移植治疗大鼠脊髓损伤模型,分为过表达miR-223-NSCs移植组(实验Ⅰ组)、空白载体NSCs移植组(实验Ⅱ组)和对照组(仅造模).移植后12、24h、3d及7d,分别行实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及原位杂交检测miR-223和RhoB表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6表达水平.结果 慢病毒转染后,NSCs表达miR-223倍数上升至6.9±1.9.FQ-PCR结果显示:移植治疗后,实验Ⅰ组在脊髓损伤部位表达miR-223逐渐上升,3d出现表达高峰(11.64±1.82).各时间点实验Ⅱ组及对照组表达均较低,且两者间差异无统计学意义(P＞0.05).RhoB在各时间点的表达趋势与miR-223相反:移植治疗后3d,表达下降至低(0.31 ±0.08).原位杂交直观地印证了FQ-PCR结果.ELISA结果显示:移植后12h,TNF-α和IL-6表达均达到高峰.TNF-α随着时间表达下降,各时间点均以实验Ⅰ组的表达低.IL-6的表达在对照组及实验Ⅱ组损伤后3d出现第2个高峰,而在实验Ⅰ组则持续下降.结论 miR-223通过靶基因RhoB调控炎性因子TNF-α和IL-6的表达,过表达miR-223-NSCs移植可能具备脊髓损伤的治疗作用.
-
miR-126靶向调控IRS1，SLC7A5及TOM1基因抑制结肠癌的增殖及侵袭转移
目的：通过研究miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞生物学行为的影响，了解miR-126在结肠癌发生发展中的作用。方法：利用原位杂交在高密度人结肠癌组织芯片中研究miR-126的表达，通过慢病毒转染构建miR-126稳定过表达细胞系，并进一步通过体外实验研究miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果：miR-126在人结肠癌组织中表达下调，在存在侵袭转移患者的结肠癌组织中下调尤为明显。miR-126的表达与患者是否发生转移及结肠癌临床分期、Duke’s分期相关(P<0.05)，且miR-126下调越明显，患者预后越差(P=0.025)。利用慢病毒转染构建的miR-126过表达SW480细胞系进行体外实验显示结肠癌细胞中恢复miR-126的表达可抑制结肠癌细胞增殖，使其出现G1期阻滞并促进结肠癌细胞凋亡、抑制结肠癌细胞迁移和侵袭能力。同时miR-126可明显增强结肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性。进一步生物信息学分析及qRT-PCR结合蛋白免疫印迹法验证IRS1，SLC7A5及TOM1可能为miR-126在结肠癌中的靶基因。结论：miR-126可明显抑制结肠癌的发生发展，且与结肠癌患者预后密切相关，其可能调控的靶基因为IRS1，SLC7A5及TOM1，miR-126有望成为结肠癌临床诊断及治疗的新靶点。
-
慢病毒转染和电转染原代C57BL/6小鼠神经干细胞的比较
目的 比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣,获得神经干细胞高效转染的方法 .方法 从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞,进行原代培养;分别进行慢病毒转染和电转染,通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,比较两种转染方法的转染效果,并用噻唑蓝(MTT)法计算相对存活率,比较两种方法转染后对细胞的影响.结果 慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后,慢病毒的转染率为(77.6±6.6)%,高于电转染法转染率[(29.2±4.8)%],两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);转染72 h后,慢病毒转染的细胞荧光表达量为(60.0±3.6)%,电转染细胞的荧光表达量仅剩(12.8±2.4)%;MTT法结果显示,电转染组细胞相对存活率为(75.8±2.3)%,慢病毒转染组细胞相对存活率为(70.1±1.4)%,两者比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 对于原代神经干细胞转染,慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性,转染后细胞存活率与电转染法接近,因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求.
-
人源性ApoE4基因转染PC12细胞株建立及麦芽酚铝对其细胞活力影响
目的 建立人源性载脂蛋白E4(ApoE4)基因转染的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞(以下简称"PC12细胞"),探讨麦芽酚铝对该细胞株细胞活力的影响.方法 将携带有人源性ApoE4基因重组慢病毒载体转染PC12细胞株,用嘌呤霉素进行筛选,获得ApoE4稳定过表达PC12细胞株(PC12-ApoE4组)和阴性空载体对照PC12细胞株(PC12-NC组).采用实时荧光定量聚合酶链反应法分别检测PC12组、PC12-NC组、PC12-ApoE4组细胞的R-ApoE和(或)H-ApoE-FLAG的mRNA相对表达量,以鉴定构建效果.分别用浓度为0.00、100.00、200.00和400.00μmol/L的麦芽酚铝溶液对PC12-ApoE4组和PC12组细胞染毒24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率.结果 PC12-ApoE4组、PC12-NC组细胞荧光显微镜下均可见荧光表达,提示转染成功;PC12组细胞未见荧光表达.PC12组细胞R-ApoE基因、PC12-NC组细胞R-ApoE基因、PC12-ApoE4组细胞H-ApoE-FLAG基因的mRNA的相对表达量的中位数分别为1.00、1.01和148.74;其中,PC12组与PC12-NC组细胞R-ApoE基因的mRNA的相对表达量均低于PC12-ApoE4组细胞H-ApoE-FLAG基因(P<0.01).麦芽酚铝染毒后,细胞存活率在染毒剂量及细胞类型的主效应以及交互效应上均有统计学意义(P<0.01);其中,麦芽酚铝在0.00～400.00μmol/L浓度下,随着染毒剂量的增加,2种细胞的细胞存活率均降低,均呈剂量-效应关系(P<0.01).结论 成功构建稳定表达人源性ApoE4基因的细胞株.麦芽酚铝和ApoE4基因对PC12细胞存活率的影响存在交互作用,ApoE4基因可增强麦芽酚铝对PC12细胞的细胞毒性.
