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3种诱导法诱导CD73+脂肪间充质干细胞成心肌细胞效果的比较
目的 从脂肪来源的间充质干细胞(ADMSCs)的混合细胞群中分离纯化出CD73阳性的细胞亚群,证明几种不同诱导法诱导CD73细胞的成心肌分化潜能.方法 体外分离培养1～3月龄小鼠的ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73两个细胞亚群.分别培养两组细胞,利用5-氮杂胞苷(5-aza)、心肌组织裂解液和5-aza+心肌组织裂解液对两组分选出的细胞分别进行成心肌的诱导.利用免疫细胞化学技术检测3种诱导法的成心肌效果.结果 未分选的ADMSCs可分化为成脂和成骨细胞,分选的CD73+细胞具备分化为心肌细胞的良好潜能.3种诱导法均能诱导CD73+ ADMSCs向心肌方向分化,5-aza诱导CD73+ ADMSCs分化为心肌细胞率为(22.99±6.72)％,心肌组织裂解液组心肌细胞率(14.12±5.42)％,5-aza+心肌组织裂解液组心肌细胞率(26.94±6.11)％.3种方法比较,5-aza+心肌组织裂解液的诱导效果佳(P＜0.05).结论 CD73+比CD73的ADMSCs更易于分化为心肌细胞.化学诱导因素和体外模拟心肌微环境,可高效诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌细胞.
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Nanog蛋白在CD73+小鼠脂肪源间充质干细胞中的表达
目的 探讨Nanog蛋白在小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)中的表达规律.方法 体外分离培养ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73 -两个细胞亚群.体外分别培养两组细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光测定两组细胞Nanog蛋白的表达,并比较其差异.结果 CD73+ ADMSCs细胞约占总细胞的5％,形态上分为大细胞和小细胞.Nanog蛋白在CD73+ ADMSCs细胞中强阳性表达率(16.85±6.83)％,弱阳性表达率(81.78 ±7.19)％,阴性表达率(1.63±3.59)％；nanog蛋白在CD73 - ADMSCs细胞中强阳性表达率(5.74±2.79)％,弱阳性表达率(85.84 +37.31)％,阴性表达率(8.42±4.12)％.在Nanog阳性表达的细胞中可见不同分裂时相的有丝分裂细胞,CD73+细胞的分裂象明显多于CD73 -细胞.结论 CD73和Nanog可能均是ADMSCs特异性表达的标志,Nanog蛋白强阳性的细胞可能更具幼稚性.通常采用分离培养方法获得的ADMSCs是多种细胞的复合物.
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骨髓和脂肪源多潜能间充质干细胞的比较研究
①目的 比较骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞的生物学特性.②方法 分离人的骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞进行体外培养,通过绘制生长曲线,比较细胞的增殖能力;利用流式细胞仪分析细胞表型,并与诱导培养比较细胞的分化潜能进行比较.③结果 脂肪源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞具有相当的生物学特性,且在增殖能力方面优于骨髓源间充质干细胞.④结论 人脂肪组织可能成为一种新的间充质干细胞来源.
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尾静脉移植人脂肪干细胞在脑缺血大鼠脑内的存活
背景:间充质干细胞移植可显著改善缺血性脑血管病神经功能.目的:观察尾静脉途径移植人脂肪源间充质干细胞对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响.方法:制作局灶性脑缺血大鼠模型,随机分为实验组和对照组,实验组在造模后3 d尾静脉注射5×106脂肪源间充质干细胞,对照组不进行细胞移植.结果与结论:两组大鼠神经功能缺损行为学评分随着细胞移植后时间延长均逐渐降低.移植后第14,21天,实验组大鼠行为学评分较对照组显著降低(P < 0.05),且实验组改善程度明显优于对照组(P < 0.01);移植的人脂肪源间充质干细胞在局灶性脑缺血大鼠血管周边和缺血周边区聚集并存活.说明尾静脉移植的脂肪源间充质干细胞可在宿主脑内存活,并改善神经功能.
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microRNA-125b在Flk1~+脂肪源间充质干细胞向神经分化过程中的表达变化
背景:间充质干细胞的分化受遗传和表观遗传因素的严格调控,越来越多的研究表明microRNA也在这一过程中发挥重要的调控作用.目的:观察microRNA-125b在Flk1~+ 1间充质干细胞向神经细胞分化过程中的表达变化.方法:成人脂肪样品取自15～35岁健康志愿者,贴壁培养法获得间充质干细胞,采用神经诱导培养基对第3代间充质干细胞进行诱导培养.在诱导第0,4,8,12天检测microRNA-125b的表达情况.应用microRNA芯片技术检测间充质干细胞在神经诱导前后microRNA-125b的表达差异并采用反转录-聚合酶链反应和Taqman real-time PCR的方法进行验证.检测inhibitor抑制microRNA-125b表达的有效性.结果与结论:①实验成功诱导间充质干细胞向神经分化,诱导培养后12 d观察到细胞形态发生变化;大部分细胞胞体回缩,呈球形,并有轴突形成,免疫荧光检测结果显示,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞特征性表面标志.②RT-PCR和Taqman real-time PCR显示神经诱导后microRNA-125b表达明显升高,与microRNA芯片结果一致.③inhibitor可以有效抑制microRNA-125b的表达.提示microRNA-125b可能在间充质干细胞成神经分化过程中起调控作用.
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成人脂肪源间充质干细胞治疗顽固急性移植物抗宿主病
背景:目前为止,医学界仍然没有一种有效的策略治疗对糖皮质激素耐药的、严重的急性移植物抗宿主病;很多药物包括抗胸腺细胞球蛋白、霉酚酸酯、喷司他丁及单克隆抗体等均已经临床尝试,但疗效均不尽人意.目的:进一步评价成人脂肪源间充质干细胞作为挽救方案用于治疗对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病.设计:临床实验.单位:河南省肿瘤医院,河南省血液病研究所血液科.对象:实验于2002-09/2005-08在河南省血液病研究所完成,经河南省肿瘤医院医学伦理委员会批准.共有8例出现Ⅲ~Ⅳ度对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病的患者入选本实验,患者及脂肪源间充质干细胞供者对治疗及实验均知情同意.方法:8例对糖皮质激素耐药的Ⅲ~Ⅳ度急性移植物抗宿主病患者患者均经静脉输入成人脂肪源干细胞(剂量为1.0×106/kg),其中1例患者接受两次成人脂肪源干细胞输注,其余7例患者均接受一次成人脂肪源干细胞治疗.在这8例患者中,4例患者接受的成人脂肪源干细胞来源于HLA配型完全相合的家庭供者,其余4例患者接受的成人脂肪源间充质干细胞来源于无血缘关系的无关供者.主要观察指标:成人脂肪源间充质干细胞用于治疗对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病的疗效.结果:所有接受成人脂肪源间充质干细胞治疗的8例患者均无明显副作用出现;在接受成人脂肪源干细胞治疗的8例患者中,除1例患者(后死于多器官功能衰竭)对治疗无反应外,另7例患者的病情(对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病)很快得以缓解;在对成人脂肪源干细胞治疗反应良好的7例患者中,有6例患者存活11～90个月,中位时间30个月,其中4例患者目前仍处于血液学完全缓解状态且生存状况良好,另1人在接受成人脂肪源干细胞治疗后13月后死于白血病复发.结论:成人脂肪源间充质干细胞非常有希望用于治疗对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病.
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C57小鼠脂肪及骨髓间充质干细胞生物学特性的比较
背景：研究发现，脂肪源干细胞具有和骨髓间充质干细胞一样的贴壁和形成成纤维样克隆特性，并具有向骨、脂肪、软骨等多系分化的能力。
目的：比较C57小鼠脂肪源间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的生物学特点。
方法：在无菌的条件下分别从C57小鼠的脂肪和骨髓中获取脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。体外分离、培养并将脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞传至第3代，进行细胞形态、表面标记、生长动力学分化潜能测定和Notch信号相关基因的检测。
结果与结论：脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞形态学相似，第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达CD29、CD105、Sca-1，不表达CD34、CD133，但骨髓间充质干细胞还表达CD45；生长曲线和细胞克隆分析显示脂肪间充质干细胞的增殖速度明显比骨髓间充质干细胞快；脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均可向成骨、成脂、成软骨诱导分化，脂肪间充质干细胞更易向成骨诱导；Notch 相关基因检测显示脂肪源干细胞的 Jagged-1表达水平明显比骨髓间充质干细胞低，而 Hes-1的表达水平脂肪源干细胞明显高于骨髓间充质干细胞的表达水平。提示脂肪间充质干细胞比骨髓间充质干细胞扩增能力更强，更易向成骨分化,可能与Hes-1表达水平有关。 -
干扰p73基因对脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的影响
目的 研究抑制p73蛋白的表达,对体外培养的脂肪来源间充质干细胞向骨、脂肪和神经细胞方向分化的影响.方法 ① 流式细胞仪研究抑制p73的表达对人脂肪源间充质干细胞免疫表型影响;②体外转染的脂肪间充质干细胞向成骨和脂肪方向诱导,观察抑制p73的表达对其分化能力的影响;③ 体外诱导脂肪间充质干细胞神经细胞分化,实时定量PCR分析抑制p73的表达对其向神经细胞分化的影响.结果 抑制p73的表达,对脂肪间充质干细胞的免疫表型以及成骨和成脂分化无明显影响,但影响细胞在体外向神经细胞分化的能力.结论 p53家族蛋白成员p73在脂肪间充质干细胞体外向神经细胞的分化的过程中起重要的作用.
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脂肪源间充质干细胞对小鼠急性肾损伤后干细胞因子及其受体表达的影响
目的 研究脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)对急性肾损伤(AKI)的治疗作用,并探讨ADMSCs治疗小鼠AKI可能的机制.方法 30只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组,每组10只.应用腹腔注射顺铂建立AKI模型,治疗组于注射顺铂12 h后尾静脉注射ADMSCs悬液,模型组于注射顺铂12 h后尾静脉注射等量生理盐水.注射顺铂7d后处死小鼠,通过测定血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平及观察小鼠肾组织形态学改变判断肾损伤情况;免疫组织化学法检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、干细胞因子受体(c-KIT)及干细胞因子(SCF)表达情况.结果 与模型组比较,治疗组BUN、Scr和NGAL水平显著下降(P＜0.01),肾小管坏死(ATN)评分显著降低(P＜0.01),c-KIT、SCF表达显著增加(P＜0.01);与正常对照组比较,模型组c-KIT、SCF表达亦显著增加(P＜0.01).结论 在AKI小鼠模型中,外源性ADMSCs可能通过旁分泌SCF、c-KIT,并激活SCF/c-KIT信号通路来促进肾小管细胞的修复,继而达到保护受损肾脏的作用.
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小鼠脂肪源间充质干细胞的培养鉴定及增强绿色荧光蛋白-慢病毒载体转染
目的 探索脂肪源间充质干细胞(A DMSCs)的分离培养方法、生长特性及筛选出慢病毒载体感染间充质干细胞的佳感染指数(MOI),并鉴定其感染后的增殖能力,为ADMSCs移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据.方法 取4周龄昆明小鼠腹股沟脂肪组织,差速贴壁法培养分离昆明小鼠脂肪源间充质干细胞.经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶,放置体积分数5％ CO2孵箱中培养,24h后换液,以后每3d更换培养基,待细胞融合达到约90％时,传代培养.取第3代ADMSCs用流式细胞术(FCM)检测其表型、茜素红染色及油红O染色鉴定其多向分化潜能;用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体(LV)感染ADMSCs,FCM检测病毒感染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染后的细胞活力.结果 (1)差速贴壁法培养分离7～11d时细胞融合达80％以上.原代细胞融合达80％～ 90％进行1:4传代,细胞贴壁和生长速度快于原代细胞培养.第3代及再传代细胞形体趋于一致,细胞呈梭形.细胞连续传代10次,生长速度未见明显减缓;(2) FCM检测第3代细胞CD29阳性表达98.93％,CD34阳性表达0.17％;(3)第3代细胞成脂诱导14 d油红O染色阳性,成骨诱导14 d茜红染色阳性;(4)当MOI=25感染第3代细胞72 h后,共聚焦荧光显微镜观察细胞EGFP阳性表达60％ ～ 70％,细胞活力不受影响;(5) MTF法显示重组慢病毒转染细胞与未转染慢病毒细胞比较,细胞增殖能力无差异.结论 从昆明小鼠腹股沟脂肪组织中分离的ADMSCs可在体外稳定传代;差速贴壁法可以简便、高效地提取ADMSCs;携带EGFP的LV可有效感染ADMSCs,并且感染后其增殖能力不受影响.
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体外诱导大鼠脂肪源间充质干细胞成肌腱潜能的研究
目的 体外诱导脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AT-MSCs)成肌腱细胞,为临床肌腱损伤的修复提供理论基础.方法 从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出脂肪源间充质于细胞,经生长分化因子-5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导,使其向肌腱细胞分化.应用形态观察和RT-PCR等方法,从形态和分子水平上对诱导分化的细胞进行鉴定.结果 从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出的AT-MSCs呈散在分布,排列不规则,以星形和多角形细胞为主,能稳定增殖传代.经5、10ng/mL GDF-5诱导8d后,大部分细胞呈梭形.RT-PCR结果显示经GDF-5诱导的细胞,I型和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显高于未经诱导的对照组;GDF-5诱导的细胞Bcl-2/Bax均高于对照组.结论 从脂肪组织中可以获得具有多向分化能力的AT-MSCs,并能在体外稳定传代.经GDF-5诱导后,AT-MSCs有向肌腱细胞分化的倾向.GDF-5在一定时间内对细胞凋亡有抑制作用,有利于AT-MSCs向肌腱细胞的分化.AT-MSCs有可能替代骨髓间充质干细胞作为组织工程学的种子细胞,用于肌腱损伤的修复.
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差速贴壁法分离培养脂肪源间充质干细胞
目的:探讨差速贴壁法从大鼠腹股沟脂肪垫分离纯化脂肪源间充质干细胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells,ADMSCs)的可行性.方法:采用差速贴壁培养法分离ADMSCs,并与普通培养法得到的ADMSCs进行表面分子CD44阳性率对比.在第2代ADMSCs中加入条件培养基进行诱导,根据条件培养基的不同分成3组:①成骨诱导组:加入成骨培养基;②成脂诱导组:加入成脂培养基;③对照组:仅加入基础培养基.成骨诱导组和对照组进行碱性磷酸酶(ALP)检测,成脂诱导组和对照组进行油红O染色检测.结果:差速贴壁培养法获得CD44阳性率更高的ADMSCs.成骨诱导组的ALP大大高于对照组,成脂诱导组油红O染色阳性,对照组油红O染色均为阴性.结论:差速贴壁培养法从大鼠腹股沟脂肪垫中分离得到高纯度ADMSCs.
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超小超顺磁氧化铁颗粒标记对脂肪源间充质干细胞生物学特性的影响
目的 使用超小超顺磁氧化铁颗粒(USPIO)对大鼠脂肪源间充质干细胞(ADSCs)进行体外标记,研究不同浓度的USPIO对大鼠ADSCs生物学活性的影响,确定其标记ADSCs的适宜浓度. 方法 实验分为8个组,其中6组依次添加不同终浓度的USPIO(180 μg/mL、135 μg/mL、90 μg/mL、45 μg/mL、22.5 μg/mL、11.25μg/mL),另2组为阴性转染组和空白对照组.普鲁士蓝染色检测USPIO标记ADSCs的效率,同时采用CCK-8及Alamar blue法检测各组细胞增殖情况. 结果 USPIO标记浓度在45 μg/mL时,普鲁士蓝染色后ADSCs胞浆内可见大量蓝色颗粒,标记效率在95％以上；USPIO标记浓度在90 μg/mL及以上时,标记效率约100％.CCK-8及Alamar blue检测结果表明USPIO在11.25～90 μg/mL范围内对细胞活力的影响较小且差异无统计学意义(P＞0.05),故可将45-90 μg/mL确定为适宜浓度. 结论 USPIO可在体外有效标记ADSCs,并且在适宜浓度范围内对细胞生物学活性无明显影响.
关键词： 脂肪源间充质干细胞 超小超顺磁氧化铁颗粒 细胞活力 -
骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究
目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.
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脂肪间充质干细胞移植治疗糖尿病足的研究进展
糖尿病足是糖尿病的严重并发症之一,近年来的研究显示,脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,A-MSCs)作为一种来源充足的干细胞,在糖尿病足治疗方面具有很大的潜力.我们总结了近年来A-MSCs应用于糖尿病足的研究进展,并提出了其可能的机制及展望.
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成年人脂肪源间充质干细胞治疗急性移植物抗宿主病后CD+8 T细胞亚群的变化
目的 初步探讨成年人脂肪源间充质干细胞(AMSC)治疗急性移植物抗宿主病(aGVHD)的分子机制.方法 3例行异基因造血干细胞移植术后发生aGVHD的患者,以每1 kg体重2×106个细胞剂量静脉输注AMSC;首先应用尼龙毛柱分离外周血T淋巴细胞,再经CD8磁珠分选出CD+8 T淋巴细胞,应用流式细胞术检测发生aGVHD患者使用AMSC前后外周血CD+8 T细胞亚群的变化.结果 与输注AMSC前相比,输注AMSC后,CD+8 T细胞中的CD+8CD-28亚群显著上调,同时,患者的aGVHD得以有效控制.结论 AMSC治疗aGVHD的作用机制可能与其上调CD+8CD-28T细胞亚群有关,CD+8 T细胞可能是AMSC作用的靶细胞.
关键词： 脂肪源间充质干细胞 急性移植物抗宿主病 CD+8 T细胞亚群
